En effektiv Manuell styckning förfarande för framställning av Intakt Mouse Nasal Tissue med bibehållen Anatomical Organization

Abstract

Den däggdjur näsa är en multi-fungerande organ med intrikata inre strukturer. Näshålan är fodrad med olika epitel såsom lukt, andningsorganen och skivepitel som skiljer sig markant i anatomiska platser, morfologi, och funktioner. I vuxna möss, är näsan täckt med olika skallben, begränsar experimentell tillgång till interna strukturer, särskilt i den bakre som den viktigaste luktepitel (MOE). Här beskriver vi en effektiv metod för att erhålla nästan hela och intakta nasala vävnader med bevarade anatomiska organisation. Använda kirurgiska verktyg under ett dissekera mikroskop, tar vi sekventiellt skallben omger nasal vävnad. Denna procedur kan utföras på båda paraformaldehydfixerade och nyligen dissekeras, flådda mus huvuden. Hela urbening proceduren tar ca 20-30 min, vilket är betydligt kortare än den experimentella tid som krävs för konventionell kemisk-baserade deförkalkning. Dessutom presenterar vi en enkel metod för att avlägsna luftbubblor fastnar mellan turbinates, vilket är avgörande för att erhålla intakta tunna horisontella eller koronala eller sagittal avsnitt från nasal vävnad förberedelse. Nasal vävnad framställd med hjälp av vår metod kan användas för hela montera observation av hela epitelet, samt morfologisk, immuncytokemiska, RNA in situ hybridisering, och fysiologiska undersökningar, särskilt i studier där region-specifik undersökning och jämförelse är av intresse.

Introduction

Den däggdjur näshålan innehåller olika typer av vävnader och organ som tjänar olika funktioner. Den näshålan utgör ingångsdel av de övre luftvägarna, vilket tillåter luft att resa in i och ut ur lungorna. Inandningsluften passerar genom näshålan där det genomgår temperatur och luftfuktighet konditionering ¹ samt rengöring eller filtrering för att ta bort irriterande och giftiga ämnen och infektiösa mikroorganismer ^2. Båda behandlingarna utförs av näsepitelet och subepitelial vävnad, inklusive körtlar och fartyg och är avgörande för att skydda de nedre luftvägarna och lungorna. Förutom sin roll i andning och epitelial försvar, innehåller den nasala vävnaden också perifera sensoriska apparater av lukt och trigeminal system som detekterar ett brett spektrum av kemiska ämnen i den passerande luften. Beroende på vilken systemet är aktiverat, kan sensorisk upptäckt av kemikalier i näsan framkallar antingenen känsla av lukt, irritation eller smärta ^3,4.

Den perifera Luktsinnet är komplext och består av flera anatomiskt åtskilda lukt sensoriska organ i näshålan. Bland dem är det viktigaste luktepitel (MOE) den största, vilket utgör cirka 45-52% av näsepitelet hos gnagare ⁵ och är belägen i den bakre regionen. I anteroventral regionen finns det ett par av rörformiga strukturer som kallas det vomeronasala organet ^6, som sitter längs varje sida av nässkiljeväggen. Två ytterligare små grupperingar av lukt sensoriska neuroner, känd som septal organ Masera ^7,8 och Grüneberg ganglion ^9, bor längs den ventrala septum och den dorsala posten regionen av näshålan, respektive. Dessa perifera organ innehåller neuro-epitel med särdrag i morfologi, cellmarkör uttryck och fysiologisk funktion. Tillsammans upptäcker tusentals luktmolekyler med utsökt känslighet ^10-12.

Förutom de lukt sensoriska organ, inrymmer näshålan även andra sensoriska system. Det är känt att peptiderga trigeminala nervfibrer är närvarande i det nasala epitelet, särskilt respiratoriska epitelet ^13,14. Några av dessa fibrer upptäcker irriterande och giftiga kemikalier och är ansvarig för att initiera skyddsreflexer såsom hosta och nysningar ^4,15. Irriterande luktande och bittra föreningar kan också påvisas genom en nyligen upptäckt population av solitära chemosensory celler (SCCs), av vilka många är innerveras av trigeminusnerven fibrer ^16-19. Dessa SCCs ligger högre densitet i posten regionen av näshålan och vomeronasala kanaler inträde, antyda att de också kan tjäna en skyddande funktion ^16-18. Således kan näsepitelet skiljer sig väsentligt i funktion, morfologi och cellkomposition beroende på derasanatomiska platser.

Även inom en enskild och specialiserad epitel, det finns regionala skillnader. MOE är ett sådant exempel. MOE linjerna olika turbinates, som är komplicerade och böjda konstruktioner. På grund av dem olika regioner av MOE uppleva olika luftflöden och därmed olika diffusion och clearance av luftburna doftmolekylerna ^20. Dessutom är det känt att lukt sensoriska neuroner (OSN) uttrycker en given lukt receptor är belägna i en av fyra kringgås zoner av MOE ^21,22. Hur denna plats skillnaden påverkar en OSN svar till odörer är till stor del okänt. Dessutom är vissa OSN populationer uppvisar regionala preferenser. Guanylylcyklas-D (GC-D)-uttryckande OSN har områdesprogram distributioner gynnar cul-de-sac regionerna i ectoturbinates ^23,24. Mer nyligen, fann vi en delpopulation av kanoniska OSN som uttrycker transient receptor potential kanal M5 (trPM5) och är företrädesvis belägna i de laterala och ventrala regioner ^25. Dessa resultat indikerar att MOE inte är enhetlig. Men, är hur dessa regionala skillnader påverkar lukt kodning inte förstått. Detta beror delvis på att noggrann fysiologisk undersökning av MOE och näsan har begränsats av svårigheten att få intakt näsepitelet med bevarade anatomiska organisation med dagens metoder.

Den näsepitelet är huvudsakligen omgiven av främre skallben, inklusive nasal, överkäke, palatine, zygomatic, och ethmoid ben. I vuxna möss och andra modeller gnagare, dessa ben är hårt och svårt att ta bort utan att skada närstående nasal vävnad, speciellt den känsliga näsmusslan. Ofta är kemisk-baserade dekalcifikation används för att mjuka upp benen så att cryosectioning av nasal vävnader för morfologisk, immunhistokemisk och in situ hybridisering studier, men beroende på djurets ålder, kan avkalkning processen pågå över natten upp till 7 dagar ^24,26-28. Denna behandling är också begränsad eftersom det kräver vävnad vara fixativ bevarade. Dessutom kan kemisk avkalkning vara hårda och påverka immunomärkning av vissa känsliga antikroppar ^29,30. För fysiologiska studier, är levande vävnad som krävs, och därmed är dessa experiment genomförs ofta på enstaka OSN eller MOE skivor erhållna från nyfödda vars skalle ben är tunna och mjuka ^17,31,32. Fysiologiska studier kan också utnyttja hela berget förberedelser genom att huvudet delats ^25,33,34, men oftast bara den mediala ytan av näsan är lättillgängligt, begränsande fysiologiska inspelningar på andra områden.

Här beskriver vi en effektiv, manuell styckning metod att framställa intakta nasala vävnader med bevarade ursprungliga anatomiska organisation och morfologi. Vi tar bort sekventiellt de stora benen i främreskalle under ett dissektionsmikroskop för att exponera en nästan helt intakt nässlemhinnan samtidigt hålla de tunna turbinata ben intakt såvida mössen är mycket gamla och cryosectioning behövs. Vi utökar också metoden att bevara sambandet mellan de nasala vävnader och lukt lökar, liksom resten av hjärnan, vilket underlättar samtidig behandling av både perifer och central kretsar. Vår metod kan användas för att framställa paraformaldehydfixerade, samt färska, levande nasal vävnad. Således är vår metod förväntas underlätta morfologiska, immunhistokemisk och fysiologiska studier av andning, luktsinne, och nasala skador och sjukdom.

Protocol

Ett. Mus Näsa Framställning Vi använde vuxna C57BL / 6 bakgrund möss i denna studie. Alla djuromsorg och förfaranden som godkänts av Animal Care och kommittéer Använd (IACUC) i University of Maryland, Baltimore County. 1.1 Förvärva näsan från paraformaldahyde-fasta möss Figu…

Representative Results

Med denna metod, kan vi få tillförlitligt nästan helt intakt nasal vävnad. Figur 2A visar en bild av vuxen nasal prov från en paraformaldehyd-fast huvud. I detta prov, alla fyra sub-lukt sensoriska organ, inklusive MOE, septal orgel, den Grüneberg ganglion, och VNO, är intakta. Dessutom är det respiratoriskt epitel och subepitelial vävnader såsom körtlar och fartyg, bevaras. Vi har framgångsrikt använt denna metod i ett antal studier där vi undersökte morfologi, distribution, nerv innerva…

Discussion

Här visade vi en steg-för-steg förfarande för att isolera intakt lukt och respiratorisk vävnad från musen näsan genom att sekventiellt avlägsna de omgivande ben utan att skada vävnaden nedan. Vi visar att noggrann benborttagning kan bevara även de mest känsliga vävnader i sin helhet. Vi delar också insikt i de eventuella modifieringar av denna teknik, där vi isolerar både hjärnan och näsan vävnad tillsammans för att bevara nerv-anslutningen. Denna nya metod ger ett medel för att isolera hela olfactor…

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
			Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width	World Precision Instruments (WPI)	501333
Fine forceps, Dumont 3	WPI	503235
Fine forceps, Dumont 55	WPI	14099
Fine forceps, Dumont AA	Fine Science Tools (FST)	11210-20
Specimen forceps, Serrated	VWR	82027-440
Operating scissors	WPI	501753
Iris scissors, Straight	Miltex	V95-304
Dissection microscope	Olympus	SZ40
			[header]
			Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Sakura Finetek	4583
Plastic embedding mold	VWR	15160-215
Aspirator vacuum pump	Fisher Scientific	09-960-2
			[header]
			Section staining
Neutral red	ACROS Organic	CAS 553-24-2	Nuclei staining