Medindo o Crescimento e Expressão Gênica Dynamics do Tumor-Targeted<em> S. Typhimurium</em> Bactérias
Summary
O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de atenuado<em> S. typhimurium</em> Colônias de bactérias que crescem dentro dos tumores. Este vídeo aborda a preparação de células tumorais e implantação, preparação e injeção de bactérias, a imagem inteira animal-luminescência, a excisão do tumor, e contagem de colônias de bactérias.
Abstract
O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de S. atenuada colônias bacterianas typhimurium crescimento dentro dos tumores.
Geramos um modelo de xenoenxerto de tumores em ratos, por injecção subcutânea de uma linha de células de cancro do ovário humano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).
Nós transformado cepas atenuadas de S. bactérias typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) com a luciferase expresso constitutivamente (luxCDABE) plasmídeo para visualização 2. Estas estirpes colonizar especificamente tumores, permanecendo essencialmente não virulento para o rato 1.
Uma vez que os tumores eram mensuráveis estabelecido, as bactérias foram injectados por via intravenosa através da veia da cauda, com diferentes doses. Tumor-localizada, a expressão do gene bacteriano foi monitorizado em tempo real, ao longo de 60 horas utilizando umsistema de imagem in vivo (IVIS). Em cada ponto de tempo, os tumores foram excisados, homogeneizados e plaqueados para quantificar colónias bacterianas para a correlação com dados de expressão de genes.
Juntos, estes dados produz uma medida quantitativa do crescimento in vivo de expressão do gene e da dinâmica do crescimento de bactérias no interior de tumores.
Introduction
A biologia sintética progrediu rapidamente na última década e agora está posicionada para influenciar importantes problemas de energia e saúde. No entanto, a expansão na arena clínica tem sido retardado por questões de segurança e ausência de desenvolvimento de critérios de projeto para em circuitos genéticos in vivo. Acelerar aplicações médicas de alto impacto vai exigir a utilização de métodos que interagem diretamente com a infra-estrutura médica, circuitos genéticos que funcionam fora do ambiente de laboratório controlado, e hospedeiros microbianos seguras e clinicamente aceito.
Um certo número de estirpes têm sido investigados para a terapia do cancro devido à sua capacidade para crescer preferencialmente em tumores. Estes incluíram C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium 3-8. S. typhimurium tem gerado interesse particular como eles exibiram segurança e tolerância em um certo número de ensaios clínicos em humanos 9-12. Estes bactericida um foram inicialmente mostrado para criar efeitos anti-tumorais através da estimulação do sistema imunitário do hospedeiro e pela depleção de nutrientes necessários para o metabolismo de células do cancro. Produção de carga terapêutica foi adicionado mais tarde através de modificações genéticas. Embora estes estudos representam avanços importantes no uso de bactérias para as terapias do tumor, a maioria dos esforços actuais têm confiado na expressão de alto nível, que normalmente resulta na entrega de doses elevadas, os efeitos fora do alvo, e do desenvolvimento de resistência do hospedeiro 13-16 .
Agora, a biologia sintética pode adicionar a produção de carga programável, utilizando circuitos genéticos computacionalmente desenhados que podem executar detecção avançadas e entrega 17-20. Estes circuitos podem ser concebidas para funcionar como sistemas de entrega que detectam estímulos específicos de tumores e auto-regulam a produção de cargas, conforme necessário. No entanto, o estudo da função destes circuitos in vivo tem sido até agora difícil.
ve_content "> Desde plasmídeos são o quadro comum para circuitos sintéticos, nós descrevemos um método para caracterizar a dinâmica da expressão gênica baseada em plasmídeo in vivo utilizando um modelo de mouse. Estes métodos utilizam imagens luminescência time-lapse e medição quantitativa de biodistribuição. Juntos, essas abordagens fornecem uma estrutura para o estudo de redes baseadas em plasmídeo in vivo para aplicações clínicas.Protocol
Representative Results
Discussion
Usando este procedimento, somos capazes de gerar campos de tempo para o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de bactérias que colonizam tumores. Embora estas medições são rotineiramente realizados in vitro em cultura descontínua ou dispositivos microfluidics, eles são muito mais difíceis de executar in vivo.
Há diversas modificações que podem ser aplicadas a estes métodos. Quando foi utilizado o OVCAR-8 de linha de células para gerar os modelos de rat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos H. Fleming para a leitura crítica e edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Pós-Doutorado Misrock (TD) e NDSEG graduação comunhão (AP). SNB é um investigador HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
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