אדם<em> Ex Vivo</em> טרשת רובד מודל ללמוד ביולוגיה נגע
Summary
טרשת עורקים היא תהליך דלקתי כרוני. כתב יד זה מדגים קל לשימוש מודל vivo לשעבר לחקור התרדמה טריות או הפלאק בעורקים הכליליים. מודל vivo לשעבר מאפשר החקירה של חומרים פוטנציאליים על הסביבה הדלקתית בטרשת עורקי אדם ותוצאות יכולים להיות מנותח על ידי שיטות שונות.
Abstract
טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית של כלי הדם. ישנן שיטות שונות כדי ללמוד את המתחם דלקתי בטרשת עורקים. מודלים עכבר הם כלי חשוב כדי לחקור תהליכים דלקתיים בatherogenesis, אבל המודלים האלה סובלים מהבדלים פנוטיפי ופונקציונליים בין מערכת חיסון אנושית והעכברית. בניסויים במבחנה תא משמשים כדי להעריך באופן ספציפי שינויי סוג תלוי לתאים הנגרמים על ידי חומר של עניין, אבל וריאציות תלויות תרבות וחוסר היכולת לנתח את השפעתן של מולקולות ספציפיות בהקשר של המתחם דלקתי בטרשת עורקים להגביל את ההשפעה של התוצאות. כמו כן, מדידת רמות של מולקולה של עניין בדם אדם מסייעת לחקור הרלוונטיות הקלינית שלה עוד יותר, אבל זה מייצג דלקת מערכתית ולא מקומית. לכן, אנחנו כאן לתאר מודל תרבות פלאק ללמוד ביולוגיה נגע טרשתית אדםvivo לשעבר. בקיצור, לוחות טריים מתקבלים מחולים שעברו endarterectomy או מעקפי השתלה ומאוחסנים במדיום RPMI על קרח עד לשימוש. הדגימות הן לחתוך לחתיכות קטנות ואחריו חלוקה אקראית לתוך צלחת 48 היטב, המכילים מדיום RPMI בנוסף למהותו של עניין, כגון ציטוקינים או כמוקינים לבד או בשילוב לתקופות זמן מוגדר. לאחר דגירה, חתיכות השלט ניתן הלם קפוא לבידוד ה-mRNA, משובץ בפרפין או אוקטובר לצביעת אימונוהיסטוכימיה או מרוסקת וlysed למערבית סופג. יתר על כן, תאים עשויים להיות מבודדים מהרובד לניתוח cytometry הזרימה. בנוסף, ניתן לאסוף supernatants למדידת חלבון על ידי ELISA. לסיכום, vivo המודל שהוצג לשעבר פותח את האפשרות ללמוד ביולוגיה lesional דלקתית, אשר עלול לגרום לזיהוי מנגנוני מחלה רומן ומטרות טיפוליות נוסף.
Introduction
טרשת עורקים כמחלה דלקתית כרונית היא אחת מסיבות מוות עיקריות במדינות מתועשות 1-2. סיבוכים של טרשת עורקים, תסמונת כלילית חריפה במיוחד, נמצאו קשורים לקרע של נגעים פגיעים, גורמים atherothrombosis וכלי חסימה 3. נראית חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות להיות מעורבת בכל השלבים של atherogenesis 2,4-5. למרות התקדמות משמעותית נעשתה בטיפול באוטם שריר הלב, מניעה יעילה של טרשת עורקים ואירועי לב וכלי דם שליליים עדיין לא פתורים. לפיכך, ללמוד ביולוגיה lesional הוא חיוני להגדלת הידע שלנו על הפתופיזיולוגיה של טרשת עורקים ולאפשר זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות ופיתוח של טיפולים חדשניים.
במקרים רבים, מודלים עכבריים משמשים כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלות ספציפיות. עם זאת, לומד atherogenesis באמצעות מודלים עכבר הוא עכוmpanied ידי מספר מגבלות: (1) בדרך כלל, עכברים טרשתיים לקבל דיאטת כולסטרול גבוהה. רמות הכולסטרול במודלים האלה לא יכולות להיות בהשוואה לאלו בחולים עם רמות כולסטרול גבוהות בדם 6. (2) קיימים הבדלים מהותיים בין מערכת חיסון אנושית והעכברי; כך FOXP3 הוא סמן ספציפי של תאי T רגולטוריים עכבריים, ואילו ביטוי FOXP3 אדם בתאי T אנושיים לא בהכרח מקנה פנוטיפ רגולציה 7. כמו כן, הפרדיגמה Th1/Th2 כהגדרתו בבני האדם אינה ניתן להעברה באופן מלא לתאי T עכבריים. (3) מספר הסמנים המשמשים לזיהוי מונוציטים עכבריים ומקרופאגים כגון F4/80 וסמנים של קלאסי (M1) לעומת אלטרנטיבה (M2) דפוסי הפעלה אינו קיים בתאי מיאלואידית אדם 8. (4) התבטאות גנים של מונוציטים בדם היקפיים עכבריים ואנושיים כבר מצאה להיות שונה 9 באופן משמעותי.
לפיכך, על מנת להגביר את ההבנה שלנותהליכים דלקתיים כרוניים בטרשת עורקת אנושית, אנחנו צריכים לעשות שימוש במודלי עבודה עם רקמות אנושיות, דם או תאים. כאן, אנו מתארים מודל של תרבית רקמת רובד אנושית, המאפשרת חקירה של חומרי רומן פוטנציאליים בקונספט של הביולוגיה lesional דלקתית אנושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים vivo לשעבר מודל תרבות פלאק כדי לחקור את ההשפעה של חומרים שעשויים להיות רלוונטיים בביולוגיה נגע טרשתית. היתרון העיקרי של vivo לשעבר בשיטה זו הוא היכולת להעריך את השפעתם של חומרים מצויינים בתאים דלקתיים והגומלין הסלולרי שלהם, כמו גם מסלולים ומפלים…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לנדין Wambsganss לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) 682/2-1 ER ומלגת מחקר מהחברה הגרמנית לקרדיולוגיה לג Erbel כמו גם מלגת מחקר מהגרמני האקדמי שירות היידלברג לל 'זאו.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | n/a |
| FCS | Gibco | 10270-106 | n/a |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | n/a |
| 15 ml tube | Sarstedt | 62,554,502 | n/a |
| culture dish (60mm) | Orange Scientific | 5550200 | n/a |
| LPS | Sigma | L4516 | n/a |
| Cell Culture Plates 48-well | Greiner | 677102 | n/a |
| Scalpel – single use | Feather | FEA200130011 | n/a |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | n/a |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | n/a |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | n/a |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | n/a | |
Referências
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
