Isolamento de neurônios sensoriais de<em> Aplysia californica</em> Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos
Summary
Nós descrevemos a dissecação do sistema nervoso do mar marinho lebre<em> Aplysia</em> Após a anestesia, o isolamento de neurônios para a cultura de tecidos de curto prazo e gravações de correntes iônicas única célula através da técnica de patch clamp.
Abstract
O molusco gastrópode marinho Aplysia californica tem uma história venerável como um modelo de funcionamento do sistema nervoso, com particular importância em estudos de aprendizagem e memória. As preparações típicas para esses estudos são aquelas em que o sensorial e motoneurónios são deixadas intactas num animal minimamente dissecados, ou uma técnica elaborada neuronal co-cultura de motoneurónios e sensorial indivíduo. Menos comum é o isolado preparação neuronal em que pequenos grupos de neurônios nominalmente homogêneos são dissociados em células isoladas em cultura de curto prazo. Tais células isoladas são úteis para a caracterização biofísica das correntes de iões utilizando técnicas de patch clamp, e modulação específica destas condutâncias. Um protocolo para a preparação de tais culturas é descrito. O protocolo aproveita os facilmente identificáveis neurônios sensoriais glutamatérgicos do gânglio pleural e bucal, e descreve a sua dissociação e manutenção mínima in cultura durante vários dias, sem soro.
Introduction
O molusco opistobranch marinho Aplysia, tem sido um modelo neurobiológico útil para muitas décadas. Ele é mais conhecido como um modelo de habituação e condicionamento clássico 7, 8. Estudos sobre a aprendizagem e memória neste modelo ganhou o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2000 por Eric R. Kandel, em um prêmio que ele compartilhou com Arvid Carlsson e Paul Greengard 10. Estudos envolvendo gravações eléctricos de preparações reduzidas, em que os elementos do sistema nervoso deste invertebrado são dissecados do animal com nervos e músculos permanecer ligados, ajudaram a elucidar os papéis de neurónios individuais na Aplysia. A identificação dos mecanismos moleculares precisos que constituem a aprendizagem em Aplysia no entanto, muitas vezes empregue uma outra técnica, a longo prazo co-culturas de um neurónio sensorial e uma neurónios motores, um por um, obtido a partir de animais dadores individuais e deixou-se formar uma sinapse no prato de cultura 21 .
Nós e outros 1, 3, 6, 14, 15, 16 têm explorado a facilidade com a qual identificou neurônios pode ser alvo neste modelo, bem como a sua resistência em experimentos de longo prazo para fazer culturas de curto prazo dissociadas de aglomerados de neurônios nominalmente homogêneas em que estudamos correntes iônicas sob braçadeira de tensão na configuração de patch clamp. Muitos neurônios Aplysia enfrentar repetidas rodadas de remendo de fixação para dar tempo para manipulações experimentais de longa duração. A técnica é útil para os neurónios tais como as células do saco neurossecretoras do gânglio abdominal, e os neurónios sensoriais do gânglio da pleura e bucal cuja dissociação aqui descrita, mas não no caso de grandes neurónios> 60 um de diâmetro, tal como L7 ou R2 gânglio abdominal. Não empregamos soro Aplysia em nossas culturas, ao contrário dos co-culturas sensório-motoneurônio descritos em outro lugar. A maioria dos neurônios obtidos através deste procedimento será sem processos de tele primeiras 48 h em cultura, facilitando a gravação voltagem da célula inteira, mas, em seguida germinar e elaborar axónios e outros processos para cerca de 14 dias antes da morte da falta de nutrientes e / ou factores de crescimento.
Esta técnica produz culturas primárias de neurônios por 50-100 prato de regiões fisiologicamente documentados do gânglio vestibular e pleural. Este protocolo é útil para pesquisadores que estudam os aspectos da fisiologia da célula única em experimentos que requerem numerosos experimental repetições por animal. Ela produz um par correspondente de culturas devido à separação anatómica das células alvo em hemiganglia esquerda e direita, permitindo estudos que beneficiam com o tratamento combinado e as culturas de controlo.
O protocolo visa bucais S cluster (BSC) neurônios do gânglio vestibular, e ventrocaudais (PVC) neurônios do gânglio pleural pleural. Estas células são um tamanho apropriado para as gravações de tensão de células inteiras e de exibição Robust respostas glutamatérgicos. A metodologia discutido é apropriado para a maioria dos gânglios do sistema nervoso Aplysia.
Protocol
Representative Results
Discussion
As técnicas descritas aqui dissociação produzir culturas de neurônios sensoriais contendo 50-100 neurônios isolados intercaladas com um pequeno número de células gliais e outras células não identificados. Os passos mais críticos na protocolo são o momento em que o gânglio permanecem na solução enzimática, e sacudindo a dissociação dos grupos de células digeridos para quebrar o aglomerado em células individuais. Digestão enzimática (passo 1.8) tem de ser optimizada para a temperatura disponível. A 2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiado pelo NIH P40 OD010952, a Fundação Korein, da Universidade de Miami Fellowship para SLC e uma bolsa Maytag a ATK. Os autores agradecem o pessoal da Resource Nacional de Aplysia, assim como Lauren Simonitis e Hannah Peck, que forneceu micrografias para a figura.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
Referências
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