Выделение сенсорных нейронах<em> Aplysia саЩогтса</em> Для патч зажим Recordings глутаматергической Токи
Summary
Мы описываем рассечение нервной системы морской морской заяц<em> Aplysia</em> После наркоза, изоляция нейронов на короткий срок-культуре тканей, и записи одной ячейки ионных токов через технику зажим патч.
Abstract
Морских брюхоногих моллюсков Aplysia саЩогтса имеет почтенную историю как модель нервной системы, при этом особое значение в исследованиях обучения и памяти. Типичные препараты для таких исследований являются те, в которых сенсорных и двигательных нейронов остаются нетронутыми в минимально расчлененный животного или технически сложные нейронные совместное культивирование индивидуальных сенсорных и моторных нейронов. Менее распространенной является изолированной нейронной препарат, в котором небольшие группы номинально однородные нейроны распадается на отдельные клетки в краткосрочной перспективе культуры. Такие изолированные клетки могут быть использованы для биофизические характеристики ионного тока использованием патч зажим методы, а также целевые модуляции этих проводимостей. Методике получения таких культур описано. Протокол использует легко идентифицировать глутаматергические сенсорными нейронами плевральной и щечной ганглиев, и описывает их диссоциации и минимальное техническое обслуживание яРусская культура в течение нескольких дней без сыворотки.
Introduction
Морских моллюсков opistobranch, Aplysia, был полезный нейробиологическое модели на протяжении многих десятилетий. Он является самым известным в качестве модели привыкания и классического кондиционирования 7, 8. Исследования в области обучения и памяти в этой модели получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2000 году Эрик Р. Кандель, в выигрыше он поделился с Арвид Карлссон и Пол Грингард 10. Исследования с участием электрических записей с пониженной препараты, в которых элементы нервной системы беспозвоночных этого расчленены от животного с нервами и мышцами оставлена на устройстве, помогли выяснения роли отдельных нейронов в Aplysia. Идентификация точной молекулярные механизмы, которые составляют обучение в Aplysia однако, часто используют другой способ, долгосрочное со-культур сенсорных нейронов и мотонейронов, полученный по одному из отдельных животных-доноров и позволило сформировать синапс в культуральной чашке 21 .
Мы и другие 1, 3, 6, 14, 15, 16 эксплуатировали легкость, с которой определены нейроны могут быть направлены в этой модели, а также их выносливости в долгосрочных экспериментов сделать диссоциированными краткосрочных культурах кластеров номинально однородные нейроны , в которой мы изучаем ионных токов при напряжении зажим в конфигурации зажим патч. Многие нейроны Aplysia встать на неоднократные вспышки фиксации потенциала, чтобы дать время для длительных экспериментальных манипуляций. Метод полезен для нейронов, таких как нейросекреторной мешок клетках брюшной ганглий и сенсорными нейронами плевральной и щечной ганглиев диссоциации которых мы описываем здесь, но не для очень больших нейронов> 60 мкм в диаметре, такие как L7 или R2 в брюшной ганглий. Мы не используем Aplysia сыворотки в нашей культуре, в отличие от сенсорно-двигательных нейронов совместно культур описано в другом месте. Большинство нейронов, полученные с использованием этой процедуры будет без процессов тон первые 48 ч в культуре, содействие целом записи напряжения клетки, но затем прорастают и разработать аксонов и других процессов в течение примерно 14 дней, прежде чем умереть от недостатка питательных веществ и / или факторами роста.
Эта методика дает первичных культурах нейронов 50-100 за блюдо из физиологически документально регионах буккальное и плевральных ганглиев. Этот протокол является полезным для исследователей, изучающих аспекты одного физиологии клетки в экспериментах, которые требуют многочисленных экспериментальных повторяет одно животное. Он производит согласованную пару культур за счет анатомической отделение клеток-мишеней на левую и правую hemiganglia, позволяя исследования, которые соответствуют выгоду от лечения и контрольных культурах.
Протокол цели щечной S кластер (BSC) нейронов ганглиев щечной и плевральный ventrocaudal (ПВХ) нейронов плевральный ганглия. Эти клетки соответствующего размера для целой клетки напряжения записи и отображения RobusT глутаматергические ответов. Обсуждается методология подходит для большинства ганглиев в Aplysia нервной системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Диссоциации описанные здесь методы получения сенсорных нейронов культур содержащие 50-100 изолированных нейронов перемежаются с небольшими числами глии и других неустановленных клеток. Наиболее важным шагом в протоколе являются время ганглии оставаться в растворе фермента, и щелкая, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансируемых NIH P40 OD010952, Korein Фонда, Университета Майами стипендий для SLC и Maytag стипендию ATK. Авторы выражают благодарность сотрудникам Национального Ресурс для Aplysia, а также Лорен Simonitis и Ханна Пек, который предоставил микрофотографии для фигуры.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
Referências
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
