El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em> Aplysia californica</em> Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos
Summary
Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar marino<em> Aplysia</em> Después de la anestesia, el aislamiento de las neuronas para el cultivo a corto plazo de los tejidos, y las grabaciones de las corrientes de iones de células individuales a través de la técnica de patch clamp.
Abstract
El molusco gasterópodo marino Aplysia californica tiene una historia venerable como un modelo de funcionamiento del sistema nervioso, con especial importancia en los estudios sobre el aprendizaje y la memoria. Las preparaciones típicas para este tipo de estudios son aquellos en los que la sensorial y motoneuronas se dejan intactos en un animal disecado mínimamente, o neuronal de co-cultivo técnicamente elaborada de sensorial y motoneuronas individual. Menos común es la preparación neuronal aislado en el que pequeños grupos de neuronas nominalmente homogéneos se disocian en células individuales en cultivo a corto plazo. Tales células aisladas son útiles para la caracterización biofísica de las corrientes de iones utilizando técnicas de patch clamp, y la modulación selectiva de estos conductancias. Se describe un protocolo para la preparación de tales cultivos. El protocolo se aprovecha de los fácilmente identificables las neuronas sensoriales de los ganglios de la glutamatérgicas pleural y bucal, y describe su disociación y un mantenimiento mínimo in la cultura durante varios días sin suero.
Introduction
El molusco opistobranch marino Aplysia, ha sido un modelo neurobiológico útil para muchas décadas. Es mejor conocido como modelo de habituación y condicionamiento clásico 7, 8. Los estudios sobre el aprendizaje y la memoria en este modelo ganó el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2000 por Eric R. Kandel, en un premio que compartió con Arvid Carlsson y Paul Greengard 10. Los estudios que implican registros eléctricos a partir de preparaciones reducidas, en la que los elementos del sistema nervioso de este invertebrado se diseccionaron a partir del animal con los nervios y los músculos dejaron adjunta, han ayudado a aclarar los papeles de las neuronas individuales en Aplysia. Identificación de los mecanismos moleculares precisos que constituyen el aprendizaje en Aplysia sin embargo, a menudo empleado otra técnica, a largo plazo co-cultivos de una neurona sensorial y un motoneuronas, obtenido de uno en uno a partir de animales donantes individuales y se dejó formar una sinapsis en la placa de cultivo de 21 .
Nosotros y otros 1, 3, 6, 14, 15, 16 hemos explotado la facilidad con la que identifican las neuronas se pueden orientar en este modelo, así como su resistencia en experimentos a largo plazo para hacer cultivos a corto plazo disociados de grupos de neuronas nominalmente homogéneos en el que se estudian las corrientes iónicas bajo fijación de voltaje en la configuración de patch clamp. Muchas neuronas Aplysia se levantan a las reiteradas rondas de parche de sujeción para dar tiempo a las manipulaciones experimentales de larga duración. La técnica es útil para las neuronas como las células neurosecretoras bolsa del ganglio abdominal, y las neuronas sensoriales de los ganglios pleural y bucal cuya disociación como se describe aquí, pero no para las neuronas muy grandes> 60 m de diámetro, tales como L7 o R2 de el ganglio abdominal. No empleamos suero Aplysia en nuestras culturas, a diferencia de los senso-motoneuronas co-cultivos descritos en otro lugar. La mayoría de las neuronas obtenidas mediante este procedimiento no podrá contar con procesos para tél primero 48 h en cultivo, facilitando toda grabación de voltaje de la célula, pero entonces brotar y elaborar los axones y otros procesos durante aproximadamente 14 días antes de morir a causa de la falta de nutrientes y / o factores de crecimiento.
Esta técnica produce cultivos primarios de neuronas 50-100 por plato de regiones fisiológicamente documentados de los ganglios bucal y pleural. Este protocolo es útil para los investigadores que estudian aspectos de la fisiología de células individuales en experimentos que requieren numerosos experimental repeticiones por animal. Se produce un par coincidente de los cultivos debido a la separación anatómica de las células diana en hemiganglia izquierda y derecha, permitiendo estudios que se benefician del tratamiento combinado y los cultivos de control.
El protocolo se dirige bucales S racimo (BSC), las neuronas del ganglio vestibular, y ventrocaudal (PVC) pleurales neuronas del ganglio pleural. Estas células son de un tamaño apropiado para el conjunto de grabaciones de voltaje de la celda de visualización y Robust respuestas glutamatérgicas. La metodología discutida es apropiado para la mayoría de los ganglios en el sistema nervioso Aplysia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las técnicas de disociación describen aquí dió cultivos de neuronas sensoriales que contienen 50-100 neuronas aisladas intercalados con pequeños números de células gliales y otras células no identificados. Los pasos más críticos en el protocolo son el tiempo de los ganglios permanecen en solución de enzima, y agitando, la disociación de los grupos de células digeridas para romper el clúster en las células individuales. Digestión enzimática (paso 1.8) debe ser optimizado a la temperatura disponible…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiado por el NIH P40 OD010952, la Fundación Korein, de la Universidad de Miami Fellowship de SLC y una beca de Maytag para ATK. Los autores agradecen al personal de la Nacional de Recursos para la Aplysia, así como Lauren Simonitis y Hannah Peck, quien proporcionó micrografías de una figura.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
Referências
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
