Isolering av sensoriska neuroner av<em> Aplysia californica</em> För Patch Clamp Inspelningar av glutamaterg Currents
Summary
Vi beskriver dissektion av nervsystemet av den marina sjöhare<em> Aplysia</em> Efter anestesi, isolering av nervceller för kortsiktiga-vävnadsodling, och inspelningar av enstaka strömmar cell jon via patch clamp teknik.
Abstract
Den marina gastropod mollusk Aplysia californica har en ärevördig historia som en modell för nervsystemets funktion, med särskild betydelse i studier av inlärning och minne. De typiska förberedelser för sådana studier är sådana där sensoriska och motoneurons finns kvar intakt i ett minimalt dissekerade djur, eller ett tekniskt genomarbetade neuronal samodling av individuella sensoriska och motoneurons. Mindre vanligt är det isolerade neuronala förberedelser där små kluster av nominellt homogena nervceller är dissocierade i enskilda celler i kortsiktig kultur. Sådana isolerade celler är användbara för den biofysiska karakterisering av jonströmmar med hjälp av tekniker patch clamp, och riktad modulering av dessa konduktanser. Ett protokoll för framställning av sådana kulturer beskrivs. Protokollet utnyttjar de lätt identifierbara glutamaterg sensoriska nervceller i pleura och buckala ganglierna, och beskriver deras dissociation och minimalt underhåll in kultur i flera dagar utan serum.
Introduction
Den marina opistobranch mollusk, Aplysia, har varit en nyttig neurobiologisk modell för många decennier. Det är mest känd som en modell för tillvänjning och klassisk betingning 7, 8. Studier om lärande och minne i denna modell fick Nobelpriset i fysiologi eller medicin år 2000 för Eric R. Kandel, i ett pris han delade med Arvid Carlsson och Paul Greengard 10. Studier som omfattar elektriska inspelningar från reducerade preparat, i vilka delar av nervsystemet hos denna ryggradslösa dissekeras från djuret med nerver och muskler lämnas kvar, har hjälpt belysa betydelsen av enskilda nervceller i Aplysia. Identifiering av exakta molekylära mekanismer som utgör lärande i Aplysia dock ofta används en annan teknik, långsiktig samodlingar av en sensorisk neuron och en motoneuron, erhålls en efter en från enskilda givare djur och får bilda en synaps i kulturen skålen 21 .
Vi och andra 1, 3, 6, 14, 15, har 16 exploaterade den lätthet med vilken identifierade nervceller kan bli aktuella i denna modell samt deras uthållighet i långtidsförsök att göra dissocierade kortsiktiga kulturer av kluster av nominellt homogena neuroner där vi studerar jonströmmar under spänning klämma i patch clamp konfiguration. Många Aplysia nervceller stå upp till upprepade rundor av plåster fastspänning för att ge tid för långvariga experimentella manipulationer. Tekniken är användbar för nervceller såsom cellerna neurosecretory påse buken ganglion, och de sensoriska nervceller i pleura och buckala ganglierna vars dissociation vi beskriver här, men inte för mycket stora nervceller> 60 um diameter, såsom L7 eller R2 av buken ganglion. Vi anställer inte Aplysia serum i våra kulturer, till skillnad från de sensoriska-motoneuron samkulturer beskrivs på annat håll. De flesta nervceller som erhållits med hjälp av detta förfarande kommer att vara utan processer för than först 48 timmar i kultur, underlättar hela inspelningen cellspänning, men kommer sedan att gro och utveckla axoner och andra processer för cirka 14 dagar innan de dör av brist på näringsämnen och / eller tillväxtfaktorer.
Denna teknik ger primära kulturer av 50-100 neuroner per fat från fysiologiskt dokumenterade regioner i buckala och pleura ganglierna. Detta protokoll är användbart för forskare att studera aspekter av en enda cell physiology i experiment som kräver många experimentella replikat per djur. Den producerar ett matchat par av kulturer på grund av den anatomiska separering av målcellema i en vänster och höger hemiganglia, vilket medger studier som gynnas av matchade behandling och kulturer kontrollfunktioner.
Protokollet riktar buccala S cluster (BSC) neuroner i buckala ganglion, och pleura ventrocaudal (PVC) neuroner i pleura ganglion. Dessa celler är en lämplig storlek för hela inspelningar cellspänning och Robus displayt glutamaterga svar. Den diskuterade metoden är lämplig för de flesta ganglierna i Aplysia nervsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dissociation teknikerna som beskrivs här ger sensoriska neuron kulturer innehållande 50-100 isolerade nervceller varvas med små mängder glia och andra oidentifierade celler. De mest kritiska stegen i protokollet är den tid det ganglierna förblir i enzymlösning och snärta, dissociation av de spjälkade cellkluster att bryta isär klustret i enskilda celler. Enzymdigestion (steg 1,8) måste optimeras på tillgängliga temperatur. Vid 23 ° C med långsam skakning, är 13 hr tillräcklig för rötning av BSC kluste…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansierat av NIH P40 OD010952, den Korein Foundation, en University of Miami Fellowship till SLC och en Maytag gemenskap till ATK. Författarna erkänner tacksamt personalen vid Nationellt resurscentrum för Aplysia, liksom Lauren Simonitis och Hannah Peck, som tillhandahålls micrographs för en siffra.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
Referências
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
