Sensores de fluorescência são ferramentas poderosas nas ciências da vida. Aqui, descrevemos um método para sintetizar e utilizar os sensores fluorescentes baseados em dendrímero para medir o pH em células vivas e in vivo. O andaime dendríticas aumenta as propriedades de corantes fluorescentes conjugados levando a melhores propriedades de detecção.
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Artigo de método
Síntese, Entrega Celular e
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento de indicadores fluorescentes representado uma revolução para as ciências da vida. Geneticamente codificados e fluoróforos sintéticos com capacidade de sensoriamento permitiu a visualização de espécies biologicamente relevantes com alta resolução espacial e temporal. Os corantes sintéticos são de particular interesse, graças à sua alta tunability e da ampla gama de analitos mensuráveis. No entanto, estas moléculas sofrem várias limitações relacionadas com a pequena molécula de comportamento (baixa solubilidade, as dificuldades de segmentação, muitas vezes não há imagem raciométrica permitido). Neste trabalho, introduzir o desenvolvimento de sensores baseados em dendrímero e apresentar um processo para a medição do pH in vitro, em células vivas e in vivo. Nós escolhemos dendrímeros como plataforma ideal para os nossos sensores para suas muitas propriedades desejáveis (monodispersity, propriedades ajustáveis, multivalência) que lhes um andaime amplamente utilizado por vários dispositivos biomédicos feitas. A conjugação de pH fluorescenteindicadores para o cadafalso dendrimer levou a um aprimoramento de suas performances de detecção. Em particular dendrímeros exposição reduzido vazamento celular, melhor direcionamento intracelular e permitir medições raciométrica. Estes novos sensores foram utilizados com sucesso para medir o pH em células HeLa vivo e in vivo em cérebro de ratinho.
Introdução
O uso de moléculas fluorescentes para identificar moléculas biologicamente relevantes específicos mudou completamente a nossa forma de estudar sistemas biológicos. Widefield e microscopia confocal permitiu uma visualização em tempo real de alta resolução de processos biológicos e hoje estão entre as técnicas mais populares para estudar eventos biológicos in vitro, em células e in vivo. 1 Uma melhora significativa foi representado pelo desenvolvimento de indicadores de fluorescência , ou seja, corantes cuja fluorescência é dependente da concentração de uma entidade molecular específico. indicadores de pH e cálcio, em particular, t....
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Protocolo
1. Síntese dos Sensores
- Na seção seguinte, nós fornecemos um procedimento para a conjugação de indicadores de pH de dendrímeros PAMAM. O mesmo protocolo pode ser aplicado com modificações mínimas para dendrímeros de amina alternativas de rolamento. 5,17,13,14 dendrímeros e corantes comercialmente disponíveis pode ser usada sem mais purificações.
- Dissolve-se o dendrímero, em DMSO anidro (50 uM de concentração final). Prepare as soluções de 10 mM de fluoresceína-NHS e tetrametil-rodamina-NHS (TMR) em DMSO anidro.
- Adicionar à solução de dendrímero a quantidade desejada de fluoresceína e TMR. A relação molar na mistura irá reflec....
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Resultados
A Figura 1 mostra uma representação esquemática da conjugação de corantes para detectar diferentes andaimes dendríticas. Os indicadores resultantes podem ser obtidos num passo sintético fácil a partir de produtos disponíveis comercialmente. Os dendrímeros de rolamento-amina reagem com corantes NHS-activada em DMSO e purificada por meio de diálise. Este procedimento geral já foi usado com sucesso para a rotulagem de vários dendrímeros: i) geração dendrímero PAMAM 2, 4 e 6; 12 dendrímeros PAMAM.......
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Discussão
Os passos críticos para imagiologia de pH bem sucedido com sensores à base de dendrímero são: i) a selecção do andaime dendrítica correcta e o número de indicadores conjugados com ele e ii) a optimização de um protocolo de entrega do sensor nas células ou in vivo.
O procedimento de síntese é relativamente fácil e pode ser aplicado virtualmente a qualquer polímero hiper-rolamento amina. Os sensores podem ser obtidos a partir de dendrímeros disponíveis comercialmente e corantes NHS-ac.......
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Divulgações
Padrão: Autores têm nada a revelar.
Agradecimentos
Discussões úteis com Isja de Feijter e Matt Baker são reconhecido agradecimento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxifluoresceína NHS éster | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS éster | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Sacos Dyalsis | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Pratos | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Uretano | Sigma-Aldrich | U2500 |
Referências
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators w....
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Reimpressões e permissões
