Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Andrius Masedunskas; Natalie Porat-Shliom; Muhibullah Tora; Oleg Milberg; Roberto Weigert

doi:10.3791/50558

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Artigo de método

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

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DOI:

10.3791/50558

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1 de setembro de 2013

Andrius Masedunskas¹^,² , Natalie Porat-Shliom¹ , Muhibullah Tora¹ , Oleg Milberg¹^,³ , Roberto Weigert¹

¹Intracellular Membrane Trafficking Unit, Oral and Pharyngeal Cancer Branch National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, ²Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill , ³Department of Chemical & Biochemical Engineering and Department of Biomedical Engineering, Rutgers University

Neste artigo

Resumo

Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite a imagem latente vários processos biológicos em animais vivos. Neste artigo, é apresentado um método detalhado para a imagem dinâmica das estruturas subcelulares, tais como os grânulos secretores, nas glândulas salivares de ratos vivos.

Resumo

Aqui, descrevemos um procedimento para imagem estruturas subcelulares em roedores vivo que é baseado na utilização de microscopia intravital confocal. Como um órgão modelo, usamos as glândulas salivares de ratos vivos, uma vez que oferecem várias vantagens. Em primeiro lugar, elas podem ser facilmente exposta, para permitir o acesso ao sistema óptico, e estabilizado para facilitar a redução dos artefactos de movimento devido a pulsação do coração e da respiração. Isso facilita a criação de imagens e rastreamento de pequenas estruturas subcelulares. Em segundo lugar, a maioria das populações de células das glândulas salivares são acessíveis a partir da superfície do órgão. Isto permite a utilização de microscopia confocal que possui uma resolução espacial mais elevada do que outras técnicas que têm sido usadas para imagiologia in vivo, tais como a microscopia de dois fotões. Finalmente, as glândulas salivares pode ser facilmente manipulado geneticamente e farmacologicamente, proporcionando assim um sistema robusto para investigar processos biológicos a um nível molecular.

Neste estudo, centrar-se num protocolo concebido para seguir a cinética da exocitose de grânulos de secreção em células acinares e a dinâmica da membrana plasmática apical que os grânulos de secreção, se fundem com a estimulação dos receptores beta-adrenérgicos. Especificamente, nós usamos um camundongo transgênico que co-expressa GFP citosólica e um peptídeo alvo membrana fundida com a proteína fluorescente tandem-tomate. No entanto, os processos que usamos para estabilizar e imagem das glândulas salivares pode ser alargado a outros modelos de ratinho e acoplada a outras abordagens para etiquetar in vivo de componentes celulares, permitindo a visualização de várias estruturas subcelulares, tais como endossomas, lisossomas, mitocôndrias, e o citoesqueleto de actina.

Introdução

Nas últimas duas décadas, o advento de microscopia vivo e a utilização de proteínas fluorescentes levaram a grandes avanços em cada processo celular imagináveis, avançando assim a nossa compreensão da biologia das células ^1. Este campo tem beneficiado tremendamente a utilização de culturas de células de mamíferos que são sistemas de modelos extremamente poderosos, em particular quando se trata de manipulações experimentais. No entanto, eles muitas vezes não fornecem uma representação verdadeira da biologia de organismos multicelulares complexos ^2. Essa questão começou a ser abordada pelo desenvolvimento da microscopia intravital (MIV), que abriu....