Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

Summary

Neste protocolo, é introduzida a fabricação, configuração e operação básica de um biorreator picoliter microfluídico (PLBR) para análise de célula única de microrganismos procarióticos. Microrganismos industrialmente relevantes foram analisados como prova de princípio, permitindo insights sobre taxa de crescimento, morfologia e heterogeneidade fenotípica ao longo de certos períodos de tempo, dificilmente possíveis com métodos convencionais.

Abstract

Neste protocolo, a fabricação, configuração experimental e operação básica do recém-introduzido biorreator microfluídico picoliter (PLBR) são descritos em detalhes. O PLBR pode ser utilizado para a análise de bactérias e microcolônias únicas para investigar questões biotecnológicas e microbiológicas relacionadas a, por exemplo, crescimento celular, morfologia, resposta ao estresse e produção de metabólitos ou proteínas em nível de célula única. O dispositivo possui fluxo contínuo de meios, permitindo condições ambientais constantes para estudos de perturbação, mas além disso permite mudanças rápidas de meios, bem como condições oscilantes para imitar qualquer situação ambiental desejada. Para fabricar os dispositivos de uso único, um wafer de silício contendo estruturas SU-8 de tamanho submicrométrico serviu como molde de replicação para fundição rápida de polidimetilsiloxano. Os chips foram cortados, montados, conectados e configurados em um microscópio de alta resolução e totalmente automatizado adequado para imagens de lapso de tempo, uma ferramenta poderosa para análise de células espaço-temporais. Aqui, o organismo da plataforma biotecnológica Corynebacterium glutamicum foi semeado no PLBR e o crescimento celular e a fluorescência intracelular foram acompanhados por várias horas, desvendando a heterogeneidade da população dependente do tempo em nível de célula única, o que não é possível com métodos de análise convencionais, como citometria de fluxo. Além de insights sobre a fabricação de dispositivos, além disso, é demonstrada a preparação da pré-cultura, carregamento, captura de bactérias e o cultivo de PLBR de células únicas e colônias. Esses dispositivos adicionarão uma nova dimensão na pesquisa microbiológica para analisar fenômenos dependentes do tempo de bactérias individuais sob rígido controle ambiental. Devido ao processo de fabricação simples e relativamente curto, a tecnologia pode ser facilmente adaptada em qualquer laboratório de microfluídica e simplesmente adaptada às necessidades específicas.

Introduction

A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta poderosa para estudar células vivas in vivo¹. Enquanto isso, plataformas de microscopia totalmente automatizadas disponíveis comercialmente, incluindo compensação de desvio de foco induzida termicamente, são comumente aplicadas em pesquisas biológicas para estudar fenômenos dependentes do tempo, desde pesquisa de câncer e células neuronais até engenharia de tecidos e estudos dinâmicos com leveduras ou células bacterianas^2-6.

Normalmente, placas de poços transparentes, almofadas de ágar ou simplesmente lâminas de microscopia são aplicadas para fornecer ambientes de cultura de células durante a imagem de lapso de tempo⁷. Embora adequados para certas pesquisas, esses sistemas simples têm controle muito limitado sobre as condições ambientais e não permitem perturbações mais complexas ou mudanças de meio bem definidas e rápidas. Dispositivos de chip microfluídico descartáveis produzidos por produção em massa foram introduzidos no mercado recentemente, mas são principalmente adaptados para tipos de células eucarióticas maiores⁴. Embora o crescimento possa ser acompanhado, investigações de crescimento bem definidas sobre, por exemplo, aprisionamento celular preciso, tamanho da colônia, direção do crescimento e capacidade de remoção celular são limitadas. Habitats e reatores microfluídicos, nos quais as células bacterianas são cultivadas em ambientes 3D^{foram desenvolvidos 8-10}, têm desvantagens ao lidar com estudos quantitativos no nível de célula única. Embora a heterogeneidade geral da população possa ser analisada, muitos parâmetros celulares não podem ser determinados com precisão com resolução de célula única, uma vez que o crescimento não se restringe a monocamadas.

Essa limitação desencadeou o desenvolvimento de microssistemas que permitem o cultivo de células em canais e habitats bem definidos, com células crescendo em monocamadas planas com resolução de célula única e controle especialmente rígido sobre o suprimento de meios e condições ambientais^6,11,12. Poucos exemplos de sistemas microfluídicos para o cultivo de células bacterianas foram demonstrados^12-14. As bactérias normalmente exibem taxas de crescimento muito rápidas e requerem estruturas microfluídicas na faixa de poucos micrômetros e abaixo, especialmente quando as monocamadas celulares são desejadas para microscopia. Keymer et al. demonstraram crescimento e disseminação de cepas de E. coli em paisagens microfabricadas^15,16. Como estavam interessados na dinâmica populacional, não investigaram com resolução de célula única.

Desenvolvemos o biorreator picoliter (PLBR)¹³, que atualmente é aplicado para investigar vários indicadores de desempenho biotecnológico, como crescimento¹⁷ e análise de produtividade acoplada à fluorescência em nível de célula única^18,19. O presente dispositivo microfluídico permite o controle do reator ambiental em um volume de cultura definido de aproximadamente um picolitro e a observação contínua de uma única célula simultaneamente. Em comparação com os sistemas de caixa monocamada aberta^11,14, onde um ou dois lados estão abertos para o canal de fornecimento de meios, o PLBR permite captura e cultura controladas. O projeto permite o cultivo de bactérias a longo prazo sem o risco de várias colônias adjacentes formarem uma grande população. Além disso, o sistema incorpora regiões de cultivo de 1 μm de altura (na ordem do diâmetro da célula) para restringir o crescimento de bactérias a monocamadas celulares. Em contraste, os canais de alimentação são 10 vezes mais profundos para minimizar a resistência hidráulica.

Em comparação com os sistemas de cultivo em batelada miniaturizados²⁰, o presente sistema permite o cultivo com parâmetros ambientais constantes devido ao fluxo contínuo do meio. Além disso, os parâmetros ambientais, como composição do meio, temperatura, vazões e trocas gasosas, podem ser facilmente controlados e alterados em segundos. Isso permite investigações específicas da resposta celular a mudanças ambientais relativas, por exemplo, à disponibilidade de nutrientes ou estímulos de estresse. A demanda por volumes de mídia reduzidos, ou seja, na faixa de apenas alguns microlitros, permite que os pesquisadores realizem novos estudos, por exemplo, a perturbação de células durante a imagem de lapso de tempo com sobrenadante de experimentos em larga escala desvendando a resposta celular sob essas condições ambientais específicas¹⁷. O biorreator picoliter fornece aos pesquisadores um sistema robusto que controla rigidamente as condições biofísicas e é operado usando bombas de seringa de alta precisão e microscopia automatizada de campo claro e fluorescência para imagens de lapso de tempo. Aqui, relatamos um protocolo completo, incluindo design de dispositivos, fabricação e aplicações exemplares.

Protocol

1. Fabricação de wafer

1. Projete o dispositivo microfluídico contendo entradas, saídas, canais principais e os PLBRs (Figura 1A) usando software CAD.
2. O delineamento apresentado neste protocolo (Figura 2) consiste em duas entradas de semeadura, um gerador de gradiente para mistura de dois substratos diferentes, uma saída e seis matrizes de PLBRs. Cada matriz contém 5 PLBRs, resultando em 30 PLBRs paralelos dentro de um dispositivo microfluídico.
3. Crie uma fotomáscara de litografia contendo os layouts de chip desejados (Figura 1B). A fotomáscara foi produzida internamente por escrita por feixe de elétrons com resolução submicrônica. A máscara utilizada foi composta por uma camada de cromo sobre uma placa de vidro 5 em².
   Nota: execute todas as etapas a seguir em condições de sala limpa classe 100 ou melhor (um fluxograma de processo é mostrado nas Figuras 3A e 3B).
4. Limpe um wafer de silício de 4 polegadas com piranha (proporção de 10: 1 de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio) e ácido fluorídrico por vários minutos (Cuidado: produtos químicos perigosos). Enxágue com água deionizada (DI) por aproximadamente 10 segundos.
5. Desidratar o wafer por 20 min a 200 °C.
6. Gire o revestimento de 1 μm SU-8 2000.5 fotorresistente no wafer (^1ª camada) (4 ml resistem, centrifugam 10 segundos com, v = 500 rpm e a = 100 rpm/seg, centrifugam 30 segundos com v = 1.000 rpm e a = 300 rpm/s).
7. Coloque o wafer revestido em uma placa de aquecimento a 95 °C para remover o excesso de solvente (1,5 min a 65 °C, 1,5 min a 95 °C e 1 min a 65 °C; idealmente, use duas placas de aquecimento).
8. Insira a fotomáscara de^1ª camada (aqui as regiões de aprisionamento dos reatores picolitros) e o wafer dentro do alinhador de máscara e exponha o wafer a 350-400 nm (contato de vácuo, 64 mJ / cm², t = 3 seg, I = 7 mW / cm²).
9. Execute o cozimento pós-exposição em uma placa de aquecimento a 95 ° C para iniciar a polimerização do SU-8 (1 min a 65 ° C, 1 min a 95 ° C e 1 min a 65 ° C). Nota: após esta etapa, as estruturas na camada SU-8 podem ser vistas.
10. Coloque o wafer em um banho de revelador SU-8 por 1 min e transfira o wafer para um segundo recipiente com revelador SU-8 fresco por alguns segundos.
11. Enxágue o wafer em isopropanol para remover o revelador SU-8 e o wafer seco usando o fluxo de nitrogênio do girador de wafer.
12. Asse o wafer por 10 min a 150 °C.
13. Gire o revestimento de 9 μm SU-8 2010 fotorresistente no wafer (^2ªcamada) (dispense 4 ml de resistência, gire 10 segundos com v = 500 rpm, a = 100 rpm/s e gire 30 s com v = 4.000 rpm, a = 300 rpm/s).
14. Coloque o wafer com SU-8 em uma placa de aquecimento a 95 ° C para remover o excesso de solvente (15 min a 65 ° C, 45-60 min a 95 ° C e 10 min a 65 ° C). Nota: deve-se prestar atenção às rugas e bolhas. Se o wafer for aquecido a uma velocidade rápida de 95 °C, o solvente evaporado pode ser encapsulado em pequenas bolhas de gás.
15. Insira a fotomáscara com o layout desejado (aqui canais principais para fornecimento de nutrientes) e o wafer no alinhador de máscara e exponha a 350-400 nm (contato duro, 64 mJ/cm², t = 10 seg, I = 7 mW/cm²)
16. Execute o cozimento pós-exposição em uma placa de aquecimento a 95 ° C para finalizar a polimerização de SU-8 (5 min a 65 ° C, 3:30 min a 95 ° C, 3 min a 65 ° C). Nota: após esta etapa, as estruturas na camada SU-8 podem ser vistas.
17. Coloque o wafer em um banho de revelador SU-8 por 45 segundos, transfira o wafer para um segundo recipiente com revelador SU-8 fresco e desenvolva por 60 segundos.
18. Enxágue o wafer por 20 segundos com isopropanol para remover qualquer resíduo de revelador SU-8 e seque o wafer usando nitrogênio pressurizado.
19. Por fim, asse o wafer a 150 °C. Como resultado, obtém-se o wafer final (Figura 1C), que será utilizado como molde mestre para moldagem PDMS.
20. Realize medições de perfilômetro (Figura 3C) para validar as alturas da estrutura SU-8. Nota: imprecisões na altura da estrutura podem resultar em aprisionamento celular ineficiente ou perda de células durante o cultivo.

2. Fabricação de chips de polidimetilsiloxano

Nota: Todas as etapas a seguir devem ser executadas idealmente em condições de fluxo laminar para evitar que partículas de poeira interfiram no procedimento de fabricação (um fluxograma de processo é mostrado na Figura 4).

1. Prepare uma mistura de base de polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura na proporção de 10:1. Misture cuidadosamente até obter uma solução homogênea que pareça opaca. Prepare o quanto for necessário para a altura de camada desejada (aqui 3 mm).
2. Desgaseifique a mistura de PDMS por aproximadamente 30 min sob leve vácuo até que todas as bolhas tenham desaparecido.
3. Prepare o dispositivo de moldagem (ou placa de Petri) com wafer SU-8 apropriado e despeje a mistura PDMS nele (Figura 1D).
4. Asse o PDMS por 3 horas a 80 °C no forno.
5. Retire cuidadosamente a placa PDMS do wafer. Corte a placa em lascas únicas usando um bisturi limpo e afiado.
6. Lave as batatas fritas em um banho de n-pentano por 90 min, seguido de dois banhos de lavagem com acetona (90 min cada). Seque os cavacos durante a noite para remover qualquer resíduo de solvente. Atenção: efectue a lavagem do PDMS sob um exaustor. Nota: durante a lavagem do n-pentano, os monômeros e dímeros são removidos do PDMS curado e o tamanho do cavaco pode dobrar temporariamente durante o procedimento de lavagem.
7. Armazene os chips PDMS microfluídicos em recipientes fechados até o experimento final.
8. Pouco antes do experimento, perfure os orifícios de entrada e saída no chip PDMS usando uma agulha (ou perfurador) com um diâmetro ligeiramente menor do que os conectores usados para conectar a tubulação ao chip PDMS.
9. Limpe cuidadosamente o chip PDMS microfluídico com isopropanol e use fita adesiva para remover quaisquer partículas de poeira que possam grudar no lado estruturado do PDMS. Use a fita adesiva várias vezes até que nenhuma partícula possa ser vista no chip.
10. Limpe sucessivamente uma lâmina de vidro fina de 170 μm com acetona e isopropanol. Por fim, limpe com água deionizada e seque com nitrogênio pressurizado.
11. Antes da ativação do plasma, aqueça o limpador de plasma e opere o plasma por aproximadamente 300 segundos. Lâmina de vidro oxidada por plasma e chip PDMS (Potência 50 W, Tempo = 25 segundos, taxa de fluxo de oxigênio = 20 sccm).
12. Alinhe o PDMS e o chip de vidro antes de colar. Por fim, coloque o chip PDMS cuidadosamente na lâmina de vidro (Figura 1E). PDMS e vidro se unirão em segundos. Nota: não empurre com uma pinça na parte superior do chip PDMS durante o processo de colagem. Isso pode levar ao chamado colapso do telhado dos canais e pequenas estruturas.
13. Para fortalecer a ligação, cozer a última aparas de vidro PDMS durante 10 segundos a 80 °C.

3. Preparação da cultura bacteriana

Nota: Todos os cultivos devem ser preparados em meio filtrado estéril para evitar o acúmulo de partículas indesejadas, que podem interferir durante o cultivo.

1. Use uma placa de ágar contendo os organismos desejados (aqui, C. glutamicum ATCC 13032) e inocule uma colônia em 20 ml de meio BHI fresco, incube durante a noite (≈ 8-14 horas) a 30 ° C em um agitador rotativo (120 rpm).
2. Transfira 10 μl da pré-cultura para o meio desejado (aqui CGXII²¹) que será usado durante o cultivo microfluídico e deixe a célula crescer durante a noite a 30 ° C em um agitador rotativo (120 rpm).
3. Transfira a quantidade desejada de suspensão celular (entre 10-500 μl, dependendo do início do experimento) para o meio desejado (aqui CGXII²¹) que será usado durante o cultivo de células microfluídicas. Nota: o melhor é usar células da fase logarítmica inicial para a semeadura. Para a cultura de C. glutamicum, a melhor densidade óptica (OD₆₀₀) para semeadura foi entre 0,5-2.
4. Transfira 1 ml da cultura bacteriana para um tubo estéril de 2 ml. Nota: isso deve ser feito logo após a montagem do chip PDMS microfluídico para minimizar o tempo de transferência entre o frasco agitado e o cultivo microfluídico. Normalmente, o tempo de transferência é de cerca de 15 minutos e deve ser mantido o menor possível para evitar o impacto no metabolismo causado pela limitação de oxigênio e mudanças de temperatura.

4. Configuração experimental

Nota: Todas as etapas são executadas com um microscópio invertido.

1. Inicie a incubadora do microscópio 2 horas antes do experimento para aquecer o sistema. Nota: a microscopia deve ser equipada com uma incubadora de tamanho normal para controlar a temperatura e, se desejado, o fluxo de gás. Não é necessário controle adicional de umidade, pois o sistema de chips é continuamente infundido com mídia.
2. Abra o sistema de incubadora, selecione a objetiva desejada e, se necessário, adicione óleo de imersão na objetiva.
3. Monte o chip dentro do porta-chips. Se necessário, fixe a placa de vidro com fita adesiva para evitar qualquer movimento de lascas durante a operação do estágio.
4. Centralize a amostra no microscópio e concentre-se nas matrizes PLBR.
5. Conecte as entradas e saídas com a tubulação apropriada (Figura 1F). Conecte a tubulação a um reservatório de resíduos. Um chip representativo pode ser visto na Figura 4D.
6. Insira as seringas nas bombas e inicie o fluxo do meio. Use meio, tampão ou, se necessário, solução de revestimento e enxágue os canais microfluídicos por aproximadamente 1 hora. Nota: a solução de revestimento é usada para revestir as paredes do canal para evitar a adesão celular inespecífica.
7. Para E. coli, a solução de BSA a 0,1% é usada para revestir as paredes do canal. Para C. glutamicum, nenhum revestimento é necessário. Após o procedimento de revestimento, lave o cavaco com a semeadura celular prévia média.
8. Antes da semeadura e cultivo das células, verifique se não ocorre vazamento e se a temperatura é constante.

5. Semeadura de células bacterianas no dispositivo microfluídico

1. Certifique-se de que as soluções de bactérias desejadas estejam disponíveis em seringas apropriadas conectadas ao tubo.
2. Desconecte o tampão ou a solução de revestimento e conecte a suspensão da célula ao chip. Para minimizar o volume de morte, bolhas de ar indesejadas e reduzir o tempo experimental, troque a agulha completa e o tubo, em vez de apenas as seringas.
3. Infundir a suspensão celular nos canais a uma taxa de fluxo volumétrico de 200 nl / min até que a maioria dos PLBRs seja preenchida com a quantidade desejada de células ( Figura 5A ). Nota: os resultados ideais da semeadura dependem da cepa bacteriana, OD₆₀₀ e do meio de crescimento da pré-cultura. Esses parâmetros devem ser adaptados para aumentar a eficiência e o tempo de aprisionamento até que um número suficiente de células fique preso nas estruturas do reator. Para C. glutamicum, normalmente uma suspensão celular de OD₆₀₀ 0,5-2 foi usada; para E. coli, o OD₆₀₀ estava entre 0,5-1.
4. Se apenas um pequeno número de PLBRs for preenchido, aumente a vazão para 800-1.200 nl/min.
5. Desconecte a suspensão da célula e conecte o meio de crescimento ao chip (Figura 5B). Certifique-se de que nenhuma bolha de ar seja introduzida durante a troca do meio. Perfundir com meio de crescimento fresco a 100 nl/min.

6. Imageamento Time-lapse

1. Selecione PLBRs específicos para imagens de lapso de tempo. Normalmente, os PLBRs são escolhidos para conter uma única célula-mãe no início de um experimento. O número de regiões de interesse que podem ser investigadas em um experimento depende da taxa de quadros desejada e da configuração microscópica.
2. Selecione uma taxa de quadros apropriada, dependendo do número de PLBRs. Certifique-se de que o microscópio possa lidar com a quantidade desejada de ROIs no intervalo de lapso de tempo.
3. Escolha os conjuntos de filtros apropriados (aqui YFP). Feche automaticamente o obturador durante o movimento do estágio e após cada medição de lapso de tempo para evitar o branqueamento do cromóforo.
4. Configure a sequência de microscopia de lapso de tempo e inicie o experimento.
5. Depois que todos os PLBRs estiverem crescidos demais, o experimento pode ser interrompido, o chip PDMS microfluídico pode ser descartado e o experimento pode ser avaliado.

7. Análise

Nota: As etapas ou partes do procedimento a seguir podem ser executadas manualmente ou por programas de análise de imagem, como ImageJ, etc.

1. Determine os PLBRs de interesse onde o cultivo atende a todos os critérios desejados, por exemplo, número de células-mãe, posição das células-mãe, etc.
2. Para determinar a taxa de crescimento de uma microcolônia, conte o número de células em cada período de tempo.
3. Calcule a taxa máxima de crescimento plotando o tempo vs. ln (número da célula). A inclinação da parcela representa a taxa de crescimento em [1/h] (ver Figura 6).
4. A análise dos dados de fluorescência depende fortemente do experimento realizado. Neste relatório, um exemplo foi escolhido para ilustrar a heterogeneidade colônia a colônia e célula a célula entre diferentes microcolônias isogênicas (ver Figura 7).

Results

Fabricação de dispositivos

O sistema PLBR microfluídico é fabricado por uma camada de PDMS colada em um chip de vidro fino adequado para microscopia de alta resolução. A fabricação consiste em duas etapas principais: em primeiro lugar, a fabricação do mestre de replicação (Figuras 1A, 1B e 1C) e, em segundo lugar, a fabricação do chip (Figuras 1D, 1E e 1F). De acordo com o protocolo, técnicas padrão de microfabricação fotolitográfica são usadas para criar o molde mestre. Laboratórios sem instalações de sala limpa podem adquirir moldes mestres SU-8 personalizados disponíveis comercialmente. Usando moldagem PDMS repetitiva (Figuras 1A, 1B e 1C), centenas de chips descartáveis podem ser produzidos. A moldagem PDMS e a montagem de cavacos podem ser feitas em qualquer laboratório e não requerem instalações de sala limpa, no entanto, os locais de trabalho de fluxo de ar laminar são favoráveis.

O processo começa com o projeto do sistema de chip microfluídico. Normalmente, o software CAD é usado para projetar o chip microfluídico (Figura 1A). Após o CAD, uma máscara é gerada por um gravador de feixe eletrônico (Figura 1B) com resolução submicrônica. No presente estudo, foi criada uma máscara de cromo de 5 polegadas que foi usada para a litografia do wafer SU-8. O wafer final de silício - SU-8 é usado para moldagem PDMS (Figura 1D). Após uma etapa de cozimento, a placa PDMS é cortada em lascas que são irreversivelmente coladas nas lâminas de vidro (Figura 1E). Finalmente, a tubulação é conectada (Figura 1F).

A Figura 2 mostra o design do sistema microfluídico em detalhes. Consiste em duas entradas de semeadura, um gerador de gradiente para mistura de diferentes substratos ou meios e uma saída. Os canais principais têm uma dimensão de 50 μm x 10 μm (L x A). Cada dispositivo consiste em seis matrizes de PLBRs, contendo 5 PLBRs cada. Isso resulta em 30 reatores paralelizados dentro de um dispositivo microfluídico.

A Figura 3 ilustra a produção do mestre de replicação. Conforme descrito em detalhes no protocolo, uma primeira camada SU-8 é fabricada por litografia SU-8 (Figura 3A). Um procedimento semelhante é aplicado para a segunda camada (Figura 3B). Para verificar a geometria do canal, investigamos a altura dos PLBRs e canais principais usando um perfilômetro. No exemplo mostrado na Figura 3C, a primeira camada (a camada de cultivo) foi medida. Aqui a camada apresenta uma altura consistente de 1.200 nm, adequada para o cultivo de C. glutamicum em meio BHI.

A Figura 4 ilustra o procedimento de moldagem do PDMS começando com a mistura do PDMS (Figura 4A), seguido pelo processo de moldagem (Figura 4B) e, finalmente, a etapa de colagem (Figura 4C). A Figura 4D mostra o chip microfluídico final incorporando a placa de vidro de 170 μm de espessura, chip PDMS (3 mm de altura) com entradas e saídas e agulhas de aço conectadas à tubulação. Após o experimento, o chip pode ser descartado e nenhuma limpeza extensa é necessária. Além disso, é fácil de montar e manusear. Nenhum procedimento de enchimento complexo e difícil é necessário.

Princípio do dispositivo

A Figura 5 mostra o princípio de funcionamento do sistema do reator. As células são infundidas no dispositivo microfluídico e as células individuais permanecem presas dentro do PLBR simplesmente por interações célula-parede. Devido à diferença na resistência hidrodinâmica do canal e do PLBR, apenas um fluxo mínimo ocorre dentro do PLBR. Após a semeadura do PLBR (Figura 5A), a fase de crescimento e observação é iniciada com uma mudança de solução bacteriana para meio de crescimento (Figura 5B). Depois que os PLBRs estão cobertos de vegetação ( Figura 5C ), o experimento é normalmente interrompido e as imagens de lapso de tempo podem ser analisadas. Para os mecanismos de aprisionamento e perfil de fluxo dentro do PLBR, o leitor é encaminhado para Grünberger et al.¹³ para mais detalhes.

Análise da taxa de crescimento

O presente sistema pode ser aplicado para estudar várias espécies bacterianas em relação a diferentes parâmetros biológicos, como crescimento, morfologia ou sinal fluorescente. Em um primeiro exemplo, C. glutamicum, um organismo de produção industrialmente relevante, foi cultivado em condições padrão de cultivo (T = 30 ° C, meio CGXII²¹). A Figura 6A mostra as curvas de crescimento derivadas de três microcolônias isogênicas. O crescimento exponencial é mantido até que os PLBRs sejam preenchidos, indicando que não ocorre limitação de nutrientes. A Figura 6B exibe quatro imagens de microscopia de lapso de tempo DIC de uma colônia de C. glutamicum em crescimento.

Análise de fluorescência

Para microscopia de fluorescência de célula única, os pesquisadores geralmente fazem uso de proteínas fluorescentes específicas, por exemplo, GFP ou derivados, para acoplar um fenótipo específico de interesse a uma saída mensurável (um sinal fluorescente). Para demonstrar a aplicabilidade do PBLR para estudos de lapso de tempo baseados em fluorescência, investigamos a emissão de fluorescência de uma cepa de C. glutamicum produzindo uma proteína de fusão YFP-TetR codificada por plasmídeo sob controle do promotor Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) ^{18 , 22} . Na presença de baixas concentrações de indutor (IPTG), sabe-se que a expressão de Ptac leva a uma variação significativa célula a célula em populações bacterianas isogênicas. A partir de uma pré-cultura, o crescimento e a fluorescência de célula única foram seguidos por várias microcolônias isogênicas. Como pode ser visto na Figura 7, observamos heterogeneidade fenotípica entre diferentes microcolônias e heterogeneidade no nível de célula única dentro de colônias a partir de uma célula-mãe. Uma colônia (Figura 7B, PLBR 1) quase não mostrou emissão de fluorescência, enquanto as células de PLBR 2 exibiram uma baixa emissão de fluorescência devido à expressão basal de yfp-tetR do promotor Ptac. No PLBR 3, a emissão de fluorescência foi consideravelmente forte em comparação com as outras colônias e uma ampla distribuição da população foi observada. Este exemplo demonstra a aplicabilidade do PBLR para estudos de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Em comparação com a citometria de fluxo, na qual a fluorescência de células únicas pode ser determinada em um determinado momento, os sistemas atuais permitem o rastreamento de células e o estudo da fluorescência de célula única em tempo real ao longo de muitas gerações.

Figura 1.Visão geral do processo de produção de chips PLBR. Fabricação de moldes mestres: começando com (A) Projeto, (B) Fabricação de máscaras de litografia e (C) Produção de wafer. Produção de cavacos de vidro PDMS: começando com (D) de moldagem PDMS seguida por (E) colagem de vidro e PDMS e (F) montagem final de cavacos.

Figura 2. Projeto do chip PLBR. (A) Desenho CAD de todo o chip microfluídico; (B) Ampliação das posições de layout selecionadas: O layout contém duas entradas médias (a1), um gerador de gradiente com canais de mistura (a2) e 6 matrizes PLBR paralelas (b1). b2 mostra um PLBR, que está embutido em um canal de fluido com largura de 100 μm. O PLBR tem um diâmetro interno de 40 μm e canais de nutrientes com 2 μm de largura. A entrada de semeadura tem um comprimento de 40 μm. A cor rosa representa a primeira camada (região de captura e cultivo) e a cor azul representa a segunda camada (transporte de fluidos).

Figura 3.Ilustração do processo de fabricação de wafer de duas camadas. (A) Fabricação da primeira camada contendo estruturas de aprisionamento; (B) Fabricação da segunda camada contendo canais de fluido, entradas e saídas; (C) Perfis de superfície representativos da primeira camada. Neste caso, a altura da primeira camada foi de 1.200 nm e é utilizada para o cultivo de C. glutamicum em meio complexo.

Figura 4.Fabricação de dispositivos e chip representativo. Ilustração do processo de moldagem PDMS: (A) Mistura e desgaseificação de PDMS; (B) moldagem PDMS; (C) desmoldagem, corte e colagem de cavacos. Chip final (Reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry¹³): (D) fotografia do chip PDMS com 2 entradas e 1 saída; (E) Imagem CAD de seis matrizes paralelas contendo 5 PLBRs cada; (F) Imagem SEM de um PLBR.

Figura 5. Princípio de funcionamento do sistema PLBR. (A) Fase de semeadura; (B) Fase de crescimento das microcolônias bacterianas; (C) Fase de transbordamento. Reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

Figura 6.Determinação da taxa de crescimento de microcolônias WT de C. glutamicum. (A) Gráfico de crescimento de três cultivos de PLBR e curvas exponenciais resultantes (Partes reproduzidas com permissão da Royal Society of Chemistry) 13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Imagens de lapso de tempo de uma colônia de C. glutamicum em crescimento.

Figura 7. Análise baseada em PBLR da heterogeneidade da população. É mostrado C. glutamicum expressando uma fusão yfp-tetR sob o controle do promotor Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) na ausência do indutor IPTG. (A) Fluxo de trabalho experimental; (B) Três microcolônias isogênicas mostrando heterogeneidade colônia a colônia e heterogeneidade célula a célula; (C) Distribuição de fluorescência de célula única dentro das respectivas microcolônias.

Figura 8. Imagens eletrônicas de varredura de diferentes PLBRs. Imagens de MEV mostrando entradas de semeadura para a otimização da eficiência de captura. (A) Entradas de semeadura de cerveja (B) Entradas de semeadura menores (C) Entradas de semeadura "abertas" maiores (D) Duas entradas de semeadura.

passo	problema	Possível razão	solução
Fabricação de wafer	Bolhas de ar presas no SU-8 durante o cozimento suave	Aumento da temperatura para rápido	Asse a 95 °C e 65 °C várias vezes
Fabricação de wafer	Estruturas SU-8 desaparecidas e quebradas	Procedimento de fabricação não ideal; tensão mecânica em estruturas SU-8	Otimize parâmetros como tempo de cozimento, tempo de exposição
Fabricação de wafer	Camadas SU-8 para espessura de camada baixa, alta ou irregular	Problema durante o revestimento giratório	Verifique os parâmetros do revestidor giratório e o mandril de wafer
Ligação e montagem de cavacos	PLBRs em colapso	Os parâmetros de ligação do PDMS não são ideais	Ajuste a potência, o tempo de exposição do plasma. e o tempo de cozimento após a colagem
Ligação e montagem de cavacos	Estruturas e partículas sujas nos PLBRs	O chip não foi devidamente limpo	Aplique fita adesiva para limpeza de superfícies
Ligação e montagem de cavacos	Ligação insuficiente entre PDMS e vidro	Parâmetros de colagem não ideais ou limpeza insuficiente	Verifique as configurações do plasma de oxigênio
Experimento microfluídico	Vazamento de fluido	O orifício de entrada/saída não foi perfurado corretamente	Otimize o processo de perfuração
Experimento microfluídico	Muitas pequenas partículas de PDMS durante o enchimento	O furo não foi perfurado corretamente	Otimize o processo de perfuração
Experimento Microfluídico, Aspecto Biológico	Sem crescimento celular	Resíduo de solvente do procedimento de limpeza	Lave o chip mais extensivamente antes do carregamento da célula ou deixe o solvente evaporar antes da ligação
Experimento Microfluídico, Aspecto Biológico	Mudanças nas taxas de crescimento	Várias razões	Verifique a pré-cultura e a temperatura
Experimento Microfluídico, Aspecto Biológico	Alterações na morfologia celular durante o cultivo	Limitações de nutrientes ou mudança de temperatura	Verifique a incubadora e o fluxo
Experimento Microfluídico, Aspecto Técnico	Desvio de posição durante a microscopia de lapso de tempo	Flutuações de temperatura	Verifique o perfil de temperatura dos experimentos anteriores até que não haja oscilação
Experimento Microfluídico, Aspecto Técnico	Perda de células durante o cultivo	Ligeiramente a altura alta do reator	Otimize a altura do reator
Experimento Microfluídico, Aspecto Técnico	Sem armadilhas	Altura do reator muito baixa	Otimize a altura do reator

Tabela 1. Solução de problemas. Esta tabela resume aspectos críticos, erros comuns e possíveis soluções durante o trabalho experimental.

Discussion

Descrevemos a fabricação, configuração experimental e procedimentos operacionais relacionados de um dispositivo PDMS microfluídico contendo vários (PLBRs) para análise de células únicas de bactérias.

A microfabricação usando técnicas de litografia suave permite ajustes rápidos das dimensões do dispositivo para vários tamanhos e morfologias de bactérias. Atualmente estamos otimizando o biorreator picoliter em relação ao cultivo de diferentes organismos microbianos e ao rendimento do cultivo. A fim de aumentar a eficiência de aprisionamento, também a geometria do reator está sob otimização. A Figura 8 mostra quatro novos dispositivos PLBR que estão atualmente validados. Em todas as figuras, o canal de semeadura foi redesenhado em relação à largura e forma. Na prática, isso parece ter um efeito sobre o número de células que estão presas, mas precisa de mais investigações. Melhorias significativas em relação à eficiência de aprisionamento também foram alcançadas pela incorporação de canais de transbordamento adicionais, levando a um maior fluxo de convecção através do reator e mais células sendo aprisionadas. No entanto, ao mesmo tempo, aumenta-se o risco de lavar as células durante o cultivo.

O dispositivo é uma alternativa interessante aos cultivos em macroescala que têm sido usados há décadas para investigar processos de crescimento e produção em nível de célula única. No entanto, tem alguns requisitos importantes: Para o monitoramento paralelo de vários biorreatores picolitros, é obrigatória uma configuração microscópica de alta resolução e totalmente motorizada com compensação de desvio de foco. Além disso, é necessário um sistema de incubação para manter a temperatura de cultivo desejada constante durante as medições.

Alcançamos uma taxa de sucesso de 95% na fabricação de dispositivos. Os principais problemas estão relacionados à ligação ineficiente do vidro do PDMS, colapso do telhado do PDMS ou vazamento de fluido (consulte a Tabela 1 para solucionar os problemas da maioria dos problemas que ocorrem). Embora o trabalho experimental seja feito parcialmente em condições não estéreis, raramente vemos contaminação durante os experimentos, devido ao sistema fluídico fechado. Os dispositivos microfluídicos PDMS são opticamente transparentes, portanto, podem ser usados para imagens in vivo de alta resolução. Embora o PDMS pareça ser perfeito para a aplicação, ele tem uma alta afinidade por moléculas hidrofóbicas, tornando limitado o uso de solventes amplamente utilizados em processos biocatalíticos de células inteiras. No entanto, revestimentos adequados estão disponíveis para adaptar o protocolo a esses tipos de aplicações.

O PLBR proposto é adequado para análise espaço-temporal de eventos celulares e até subcelulares de vários tipos de bactérias. Uma grande vantagem da presente abordagem reside na capacidade de quantificar o crescimento de microcolônias diretamente em contraste com os métodos convencionais. Além disso, o PLBR permite o cultivo em condições definidas e constantes. Como o sistema facilita o uso de pequenas quantidades de reagentes ou materiais, ele traz as vantagens de ser barato, personalizável e passível de alto rendimento. Nos métodos tradicionais, os valores médios de toda a população são considerados ao analisar o cultivo microbiano. Além disso, os métodos existentes necessitam de amostragem manual, o que pode levar à degradação das amostras e, por conseguinte, a erros na medição. O PLBR oferece novas perspectivas para o desenvolvimento de bioprocessos e análise de heterogeneidade populacional em microbiologia. O PLBR é uma ferramenta promissora para várias aplicações no desenvolvimento de bioprocessos e pode ser aplicado em vários campos de pesquisa, por exemplo, análise de heterogeneidade célula a célula, análise de aglomerados de células específicas dentro de linhagens celulares, triagem de cepas de produção microbiana e investigação em tempo real de fenótipos celulares.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pastilha de silício de 100 mm de diâmetro, P/BOR < 100>	Si-MAT, Silicon Materials, Alemanha
Photoresist SU-8 2000.5	Micro Resist Technology GmbH, Alemanha
Photoresist SU-8 2010	Micro Resist Technology GmbH, Alemanha
SU-8 Desenvolvedor mr DEV- 600	Micro Resist Technology GmbH, Alemanha
Polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 Kit	de elastômero de siliconeDow Corning; Farnell GmbH, Alemanha
Agulhas de Distribuição Pontas de Precisão  27 G; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm	Nordson EFD Deutschland, Alemanha
Placas de vidro D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm	Schott AG, Alemanha
Perfurador AKA 5130-B-90	Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm	Saint Gobain; VWR International GmbH, Alemanha
Seringas descartáveis – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Alemanha	552-183143
Seringas, seringas de vidro estéreis de 1 ml	INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Alemanha
Chemicals
(NH4)2SO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
Ureia	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
KH2PO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
K2HPO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
MgSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
MOPS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
FeSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
MnSO4• H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
ZnSO4• 7H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
CuSO4	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
NiCl2• 6H2O	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
CaCl2	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
Biotina	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
Ácido procatecuico	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
Glucose-monohidrato	Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemanha
BHI	Becton, Dickinson
Células
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemanha
Escherichia coli MG 1655	DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemanha
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300	Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPP	SPS Europe B.V.
Alinhador de máscara MA-6	Karl Suess
Placa de aquecimento HP30A - 2	Torrey Pines Scientific
Laboratory forno Memmert UN 200	Memmert
Plasma Cleaner FEMTO	Diener Electronics, Alemanha
neMESYS bombas de seringa	Cetoni GmbH, Alemanha
Agitador magnético CB 162	Stuart	VWR 442-0304
Microscópio Nikon Eclipse Ti	Nikon Microscopia
Incubadora	Pecon GmbH, Alemanha
Centrífuga minispin plus " linha preta"			Eppendorf
Biofotômetro plus	Eppendorf	6132000008
Shake agitador/incubadora de frascos 3031	GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH, Alemanha
Profilômetro, Dektak 150 Stylus Profiler	Veeco