비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰
Summary
유사 분열을 겪고있는 암 세포에있는 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 이미징 실시간으로 기록되었다. PJ-34 근절 인간의 유방암 MDA-MB-231 세포의 유사 분열에 여분의 중심체를 숨겨 세포. 정상 이중 초점 유사 분열과는 달리, 여분 중심체는 PJ-34의 존재에있는 두 개의 스핀들 극에 클러스터되지 않았습니다.
Abstract
강력한 PARP1 억제제 역할을 페난 트렌 유도체 유사 분열의 멀티 centrosomal 인간의 암 세포에있는 여분 중심체의 이중 초점 클러스터링을 막았다. phenanthridine PJ-34은 가장 강력한 분자이다. 여분 중심체의 Declustering 멀티 centrosomal 세포에서 유사 분열 장애 및 세포 죽음을 발생합니다. 대부분의 고체 인간의 암은 여분 중심체의 높은 발생했습니다. PJ-34의 활동은 살아있는 인간의 유방암 중심체에 매우 풍부 형광 γ-tubulin의를 위해 인코딩 벡터에과 형광 히스톤 H2B 선물로 형질 전환 된 MDA-MB-231 세포의 공 촛점 이미징에 의해 실시간으로 기록되었다 염색체. 비정상적인 염색체 배열 및 declustered 중심체를 나타내는 데 클러스터 γ-tubulin의 병소는 PJ-34 치료 후 형질 전환 MDA-MB-231 세포에서 발견되었다. 두 개의 스핀들 극 유엔 클러스터 여분 중심체는 세포의 죽음을 앞에. 이러한 결과는 FO를 연결R 처음 여분 중심체 유사 분열에 드 클러스터링 및 세포 사망에 이르는 세포 분열 장애를 가진 인간의 암 세포에있는 PJ-34의 최근 발견 독점 세포 독성 활동. 두 개의 중심체와 이중 초점 스핀들과 분열을 겪고 정상 세포를 저해하지 않고 고정 된 세포 다 중심체와 PJ-34 전용 근절 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰 이전의 연구 결과에 따르면. PJ-34이 세포 독성 활성이 다른 강력한 PARP1 억제제에 의해 공유되지 않은, 그리고 PARP1 억제의 독립성을 제안, PARP1 부족 MEF 숨겨 extracentrosomes에서 관찰되었다. 공 촛점 이미징을 살고 유사 분열 동안 세포를 근절 새로운 분자를 식별하기위한 유용한 도구를 제공했다.
Introduction
페난 트렌는, PJ-34 등 PARP1 억제제, 파생 스트레스 조건 (뇌졸중이나 심근 경색 1)에 따라 에너지 소비 PARP1 매개 DNA 수선에 의해 유도 된 세포 사멸 세포 사멸에서 정지 세포를 보호하도록 설계되었습니다. 그러나 최근 우리는 PJ-34, 그 유도 PARP1 억제보다 두 배 높은 농도에서 독점적으로 인간의 암 세포 2,3에서 세포 죽음을 일으킬 수 있다는 것을 발견. 세포의 더 급속한 확산이었다, 세포의보다 효과적인 근절했다. PJ-34의 세포 독성 활동은 여분 중심체 유사 분열 2 드 클러스터링에 기인 하였다. 사람의 암세포 항구는 4,5 multicentrosomes. 효율적으로 유사 분열에서 두 개의 중심체를 숨겨 정지 세포 또는 일부 양성 증식 세포를 저해하지 않고 72-96 시간 이내에 세포를 박멸 20 μM PJ-34와 여분 중심체를 항구 인간의 유방암 세포 MDA-MB-231의 배양 <suP> 2,3. 양성 세포는 인간의 흉선에서 준비 MCF-10 인간 유방 상피 세포, 인간 내피 세포 (HUVEC) 및 기본 간엽 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 세포는 PJ-34의 세포 독성에 저항했다. PJ-34 96 시간 배양 동안 자신의 세포주기 방해하거나 자신의 중심체와 이중 초점 스핀들 형성 2,3에 영향을 미치지 않았다.
양극성 중심체 어셈블리는 유사 분열 4,5 양극성 스핀들 형성에 매우 중요합니다. 따라서 두 개 이상의 중심체를 가진 세포는 두 개의 기둥 4-9에서 자신의 별도의 중심체를 클러스터링, 거의 이해하지 분자 메커니즘을 개발했습니다. 자신의 중심체의 양극 어셈블리의 실패 체포 G2 / M 정지의 세포주기 및 세포 죽음에 이르게 4,5 유사 분열 장애에 기인하는 다극 왜곡 스핀들 및 탈선 염색체 분리가 발생할 수 있습니다. 여분 중심체 드 클러스터링을 기본 분자 메커니즘을 집중적으로 조사하는 <> 10을 먹다. 건강한 조직 5,10을 살려주는 동안이 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은 암 세포의 독점적 인 박멸을 가능하게 할 것이다.
따라서, 유사 분열 재앙 세포 죽음을 활성화 화합물은 공 촛점 이미징 여분 중심체 클러스터링에 영향을 미치는 분자를 식별하는 데 사용할 수있는 것이 좋습니다 인간의 고체 cancers.Our 결과의 넓은 범위에서 효율적일 수 있습니다 선택적 암 치료의 새로운 모드를 제공 유사 분열 2,3, 약물 후보를 대상으로 이들 화합물의 암을 렌더링합니다.
우리는 고정 살아있는 인간의 암 세포 (유사 분열의 여분 중심체의 높은 발생에) 대 정상 세포를 스캔하여 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활성을 기록했다. 단계별로 인간의 암 세포 PJ-34의 세포 독성 활동을 식별하는 데 사용되는 이미징 절차의 단계 설명은 아래에 포함되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공 촛점 이미징 유사 분열 동안 라이브 멀티 centrosomal 세포 (그림 3 및 보충 정보)의 PJ-34의 세포 독성 효과를 실시간으로 문서를 제공 살고 있습니다. 이 PJ-34 5-9으로 유사 분열 재해 세포 사멸의 유도를 제안, 여분의 중심체 드 클러스터링 및 세포 죽음에 인간의 암 세포에있는 PJ-34의 세포 독성을 돌리는 최초의 살아있는 문서이다. 대조적으로, 최고 numerary 중심체의 이중 초점 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구의 자금 출처 : 텔 아비브 대학의 기술 이전 회사 라모트와 시바 – 메디컬 센터 (M. CA 및 SI.) ICRF의 공동 기금 – 이스라엘 암 연구 재단 (M. CA.)와 이스라엘 과학 재단 ( SI).
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II |
Referências
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