Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa
Summary
Desorbimento elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (DESI-MS) è un metodo di ambiente da cui i campioni, tra cui i tessuti biologici, possono essere esposte con preparazione del campione minima. Con rastering il campione al di sotto della sonda di ionizzazione, questa tecnica a spruzzo a base fornisce sufficiente risoluzione spaziale di discernere le caratteristiche molecolari di interesse all'interno di sezioni di tessuto.
Abstract
La spettrometria di massa di imaging (MSI) fornisce informazioni non mirata molecolare con la più alta specificità e la risoluzione spaziale per studiare i tessuti biologici presso le centinaia a decine di scala micron. Quando eseguito in condizioni ambiente, pretrattamento del campione diventa inutile, semplificando così il protocollo mantenendo l'elevata qualità delle informazioni ottenute. Desorbimento ionizzazione elettrospray (DESI) è una tecnica MSI ambient spruzzo-based che consente il campionamento diretto di superfici all'aperto, anche in vivo. Quando utilizzato con una fase campione comandato da software, il campione viene rastered sotto la sonda di ionizzazione DESI, e attraverso il dominio del tempo, m / z informazione è correlata con la specie chimica 'distribuzione spaziale. La fedeltà dell'uscita DESI-MSI dipende dall'orientamento sorgente e posizionamento rispetto alla superficie del campione e l'ingresso spettrometro di massa. Qui, esaminiamo come preparare sezioni di tessuto per DESI iMAGING e condizioni sperimentali aggiuntive che influenzano direttamente la qualità dell'immagine. In particolare, si descrive il protocollo per l'imaging di sezioni di tessuto cerebrale di ratto da DESI-MSI.
Introduction
L'imaging non mirati mediante spettrometria di massa facilita l'acquisizione delle informazioni chimiche per applicazioni di scoperta e ipotesi generatrice. Imaging mirata di una sostanza chimica nota di interesse, invece, può facilitare una maggiore sensibilità e selettività attraverso specifiche sviluppo del metodo. La spettrometria di massa di imaging (MSI) è più comunemente eseguito sui tessuti mediante MALDI, 1 massa di ioni secondari spettrometria (SIMS), 2 e tecniche di ionizzazione ambiente, comprese le desorbimento elettrospray ionizzazione (DESI), 3 ablazione laser-elettrospray ionizzazione (LAESI), 4, 5 e liquidi micro-giunzione-superficie di campionamento sonda (LMJ-SSP). 6 Nella MALDI e SIMS, i campioni devono essere fisicamente rimosso dal campione, e devono essere piatta e sottile, come vengono analizzati sotto alto vuoto. MALDI richiede rivestimento del campione con una radiazione di assorbimento di matrice, aggiungendo un ulteriore passo ed ingombrante per la preparazione del campione. SIMSha la più alta risoluzione laterale, ma il bombardamento con particelle altamente energetiche provoca vasta frammentazione molecolare. Pertanto, MSI con metodi ambient riempire una nicchia in cui l'analisi morbido con la preparazione del campione minimo è auspicabile. Tuttavia, ad oggi, tutti i metodi sono ancora limitate dal requisito di superfici piane campione.
DESI usa uno spray solvente pneumaticamente assistita carico diretto alla superficie del campione di desorbire e ionizzare analiti. 7 Il modello di lavoro per il desorbimento e la successiva ionizzazione da DESI è conosciuto come il "pick-up modello goccia". 8-10 Le goccioline cariche primarie prodotta dalla sonda DESI collidono con la superficie, bagnandolo e formando un film sottile in cui l'analita viene sciolto da un meccanismo microextraction solido-liquido 8 Successivamente gocciolina collisioni provocano trasferimento di momento e decollo di gocce secondarie contenenti il materiale estratto dalla superficie . 9,10 definitiva, gasioni di fase si ritiene di essere prodotto attraverso processi ESI-come dopo evaporazione di litio, i modelli di residui di carica o di altri modelli, 11 tuttavia il processo di formazione di ioni preciso in DESI deve ancora essere provata sperimentalmente. sensibilità 12 DESI è fortemente dipendente dalla solubilità del dell'analita nel solvente spruzzo, come desorbimento basa sulla microextraction localizzata. 13
Quando utilizzato con una fase campione comandato da software, il campione viene analizzato unidirezionalmente con corsia passo sotto la sonda di ionizzazione DESI, e attraverso il dominio del tempo, m / z informazione è correlata con la specie chimica 'distribuzione spaziale (Figura 1). Dal momento che la prima prova di principio esperimento DESI-MSI riportato da Van Berkel e Kertesz, nel 2006, il 14 la tecnica è maturato notevolmente, 15 con le applicazioni riportate nella analisi dei lipidi, 3,16 metaboliti delle droghe, 17,18 diseÃsé biomarcatori, 19 tessuto cerebrale, 3,18,20 tessuto polmonare, 18 tessuto renale, 18 tessuto testicolo, 18 ghiandole surrenali, 17 tavole cromatografia su strato sottile, 21 e superfici di alghe. 22 La risoluzione di routine di immagini ottenute da DESI-MSI è 100-200 micron, che è in ultima analisi determinati dalla superficie effettiva estratta dallo spray, ma sono stati riportati risoluzioni a partire da 40 micron. 23-25 Tale risoluzione e facilità di analisi rende DESI-MSI appropriato per l'analisi rapida e semplice di campioni biologici di tessuto con superfici in cm 2 gamma 0.5-5, che consentono l'acquisizione di preziose informazioni territoriali per meglio comprendere i processi biologici 26. Qui, come esempio di una tipica applicazione DESI-MSI, passiamo in rassegna i dettagli procedurali di condurre un esperimento di successo che coinvolge l'imaging dei lipidi nei tessuti cerebrali di ratto. Le due fasi più critiche del protocollo sono laPreparazione del tessuto 27 e ottimizzazione della sorgente ionica DESI, come descritto di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'ottimizzazione della geometria sorgente DESI è critica per esperimenti MSI successo. Le molteplici variabili che contribuiscono alla allineamento del sistema influiscono direttamente sensibilità e risoluzione dell'immagine. Se durante l'ottimizzazione, lo sperimentatore ha difficoltà nell'ottenere il segnale, si consiglia di utilizzare macchia pennarello rosso disegnato sul vetrino come punto di riferimento, il colorante, rodamina 6G, m / z 443, produce un forte segnale in modalità ioni positivi e …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da ARRA NSF MRI Instrument Development Grant # 0923179 di FMF. Ringraziamo Aqua Asberry, Coordinatore Laboratorio per la Parker H. Petit Istituto di Bioingegneria e Bioscienze Istologia Nucleo, per l'assistenza con sezionamento dei tessuti.
Materials
| Reagents | |||
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura-Finetek | 4583 | http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48 |
| Acetonitrile | EMD | AX0156-6 | OmniSolv, LC-MS Grade |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092-500 ml | |
| Equipment | |||
| Cryostat microtome | Thermo Scientific | CryoStar* NX70 | Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar |
| Omni Spray;DESI Spray Head | Prosolia Inc. | Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php | |
| High Voltage Power Supply | Stanford Research Systems, Inc. | PS350/5000V-25W | http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm |
| Rope heater, RTD, controller | Omega | http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters | |
| Labview | National Instruments | Version 7.1 | |
| Translational stage | Prior Scientific | Optiscan II | http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html |
| AccuTOF Mass Spectrometer | JEOL | JMS-T100LC | Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface |
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