Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Summary

La desorción de ionización por electrospray espectrometría de masas (DESI-MS) es un método por el cual las muestras ambiente, incluidos los tejidos biológicos, se pueden obtener imágenes con la preparación mínima de la muestra. Por rastering la muestra por debajo de la sonda de ionización, esta técnica de aerosol a base proporciona una resolución espacial suficiente para discernir las características moleculares de interés dentro de las secciones de tejido.

Abstract

La espectrometría de masas de imagen (MSI) proporciona información molecular no selectiva con la mayor especificidad y la resolución espacial para la investigación de los tejidos biológicos a los cientos a decenas de escala de micras. Cuando se lleva a cabo bajo condiciones ambiente, la muestra de pre-tratamiento se hace innecesaria, simplificando de este modo el protocolo mientras se mantiene la alta calidad de la información obtenida. La desorción de ionización por electrospray (DESI) es una técnica de MSI ambiente aerosol-basado que permite el muestreo directo de las superficies al aire libre, incluso in vivo. Cuando se utiliza con una etapa de la muestra controlada por software, la muestra se tramado por debajo de la sonda de ionización DESI, y a través del dominio del tiempo, m / z información se correlaciona con la distribución espacial de la especie química '. La fidelidad de la salida DESI-MSI depende de la orientación de la fuente y el posicionamiento con respecto a la superficie de la muestra y de entrada de espectrómetro de masas. Aquí, revisamos cómo preparar las secciones de tejido de DESI imaging y condiciones experimentales adicionales que afectan directamente a la calidad de imagen. Específicamente, se describe el protocolo para la formación de imágenes de secciones de tejido de cerebro de rata por DESI-MSI.

Introduction

Formación de imágenes de Untargeted por espectrometría de masas facilita la adquisición de información química para aplicaciones de descubrimiento y de generación de hipótesis. Formación de imágenes dirigida de una sustancia química conocida de interés, por otro lado, puede facilitar el aumento de la sensibilidad y la selectividad a través del desarrollo método específico. La espectrometría de masas de imagen (MSI) se realiza con mayor frecuencia en los tejidos mediante MALDI, ¹ de iones secundarios espectrometría de masas (SIMS), ² y técnicas de ionización ambiental, incluyendo desorción ionización electrospray (DESI), ³ ablación láser de ionización electrospray (LAESI), ^{4, 5} y líquidos micro-ensambladura de la superficie Sonda de muestreo (LMJ-SSP). ⁶ En MALDI y SIMS, las muestras tienen que ser eliminados físicamente de la muestra, y tienen que ser plana y delgada, ya que se analizan a alto vacío. MALDI requiere recubrimiento de la muestra con una matriz de absorción de radiación, la adición de un paso adicional y engorroso para la preparación de la muestra. SIMStiene la mayor resolución lateral, pero el bombardeo con partículas altamente energéticas provoca graves fragmentación molecular. Por lo tanto, MSI mediante métodos ambientales llenar un nicho que es deseable un análisis suave con una preparación mínima de la muestra. Sin embargo, hasta la fecha, todos los métodos son todavía limitados por el requisito de las superficies planas de muestra.

DESI utiliza un neumáticamente asistida por disolvente de pulverización cargada dirigida a la superficie de la muestra para desorber e ionizar analitos. ⁷ El modelo de trabajo para la desorción y la posterior ionización por DESI se conoce como la "gota modelo de pick-up". ^8-10 Las gotitas cargadas primarios producida por la sonda DESI chocan con la superficie, mojando y formando una película delgada en el que el analito se disuelve por un mecanismo de microextracción sólido-líquido ⁸ subsiguiente gota colisiones resultado en la transferencia de impulso y el despegue de gotas secundarias que contienen el material extraído de la superficie ^9,10. En última instancia, el gasSe cree que los iones de fase que se produce a través de procesos ESI-como después de la evaporación de iones, los modelos de residuos de carga u otros modelos, ¹¹ sin embargo, el proceso de formación de iones precisa en DESI aún tiene que ser probada experimentalmente. ¹² DESI sensibilidad depende en gran medida de la solubilidad de los el analito en el disolvente de pulverización, como desorción se basa en la microextracción localizada. ¹³

Cuando se utiliza con una etapa de la muestra controlada por software, la muestra se escanea unidireccionalmente con el carril de paso a paso por debajo de la sonda de ionización DESI, y a través del dominio del tiempo, m / z información se correlaciona con la distribución espacial de la especie química '(Figura 1). Desde la primera prueba de principio experimento DESI-MSI reportado por Van Berkel y Kertesz en 2006, ¹⁴ la técnica ha madurado considerablemente, con ¹⁵ solicitudes reportadas en el análisis de los lípidos, ^3,16 metabolitos de drogas, enferme ^17,18biomarcadores se, ¹⁹ tejido cerebral, ^3,18,20 tejido pulmonar, ^{18 de} tejido de riñón, ^{18 de} tejido testicular, ¹⁸ glándulas suprarrenales, ¹⁷ placas de cromatografía de capa fina, ²¹ y las superficies de las algas. ²² La resolución rutinaria de imágenes obtenidas por DESI-MSI es 100-200 micras, que se determina en última instancia, por el área de superficie efectiva extraído por la pulverización, pero se han reportado resoluciones tan bajo como 40 micras. ^23-25 ​​Tal resolución y facilidad de análisis hace DESI-MSI apropiado para el análisis rápido y sencillo de muestras de tejidos biológicos con áreas de superficie en el rango de 0,5-5 cm ^2, lo que permite la adquisición de información espacial valiosa para comprender mejor los procesos biológicos ^26. Aquí, como un ejemplo de una aplicación típica DESI-MSI, se revisan los detalles de procedimiento de la realización de un experimento exitoso que implica formación de imágenes de lípidos en los tejidos de cerebro de rata. Los dos pasos más críticos en el protocolo son losPreparación del tejido ²⁷ y optimización de la fuente de iones DESI, tal como se describe a continuación.

Protocol

1. Tejido seccionamiento La tienda de tejido congelado instantáneamente, todo en congelador -80 ° C hasta que esté listo para seccionar. Dejar que la muestra de tejido para llegar a la temperatura en el criomicrotomo antes de seccionamiento (30 min). Ajuste la hoja y temperatura de la muestra a -30 ° C. Una vez que el tejido ha alcanzado la temperatura, el manejo de la muestra con pinzas, corte frontal o posterior del cerebro dependiendo de qué parte del cerebro es de interés para la…

Representative Results

La Figura 3 muestra un espectro representativo obtenido a partir de una sección de cerebro de rata no tratada. En el modo positivo, el espectro de masas está dominada por fosfatidilcolinas, debido a sus altas eficiencias de ionización (atribuido al grupo amonio cuaternario cargado positivamente). La imagen de iones total de la sección de tejido también se muestra en la Figura 3, que muestra abundante señal a través de toda la sección del cerebro. Lípidos clave detectados se ide…

Discussion

La optimización de la geometría de la fuente de DESI es crítico para experimentos exitosos MSI. Las múltiples variables que contribuyen a la alineación del sistema afectan directamente a la sensibilidad y la resolución de la imagen. Si durante la optimización, el experimentador tiene dificultades para obtener la señal, le recomendamos que utilice punto Sharpie rojo dibujado en la diapositiva como punto de referencia, el tinte, la rodamina 6G, m / z 443, produce una fuerte señal en el modo de iones positivos y s…

Materials

Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray;DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface