Fermentorer används för att öka kultur utbyte och produktivitet bioengineered celler. Efter screening flera mikrobiella eller djurcellodlingskandidater i skakkolvar, är nästa logiska steg för att öka den valda kulturens biomassa med fermentorn. Denna video visar installationen och driften av en typisk bänk bioreaktor systemet.
Jäsning system används för att ge en optimal tillväxtmiljö för många olika typer av cellkulturer. Möjligheten ges av fermentorer att noggrant kontrollera temperaturen, pH och löst syre koncentrationer i synnerhet gör dem avgörande för effektiv storskalig tillväxt och uttryck av fermentationsprodukter. Denna video kommer att kortfattat beskriva fördelarna med fermentorn över skakkolven. Det kommer också att identifiera viktiga komponenter i ett typiskt bänk jäsningssystemet och ge grundläggande instruktioner om installationen av fartyget och kalibrering av sina sonder. Tittarna kommer att bekanta sig med steriliseringsprocessen och visat hur man ympa odlingsmediet i kärlet med kulturen. Grundläggande driftsystem, provtagning, och skörd kommer även att demonstreras. Enkel analys av data och system för sanering kommer också att diskuteras.
Basic jäsning teknik är en förlängning av den enkla skakkolv teknik för att odla kulturerna. Den växte fram ur en önskan att styra tillväxtmiljöer för levande kulturer i en mer komplett och kvantitativt sätt. Satsvis odling skakflaskor är vanligen begränsade genom oprecis styrning av temperaturen. Temperatur enhetlighet i en inkuberade shaker eller varmt rum är mycket varierande, ibland förirra 5 ° C eller mer från den avsedda börvärdet. Eftersom skakkolv normalt agiterades vid en fixerad hastighet, är syreupptag och gasutbyte begränsad. När den tillgängliga omgivande syret är slut, de flesta kulturer inte mår bra. Det finns ingen pH-kontroll i skakkolvar. I många fall, om kulturen inte begränsas av råvara blir det surt till den grad att skada för kultur och andning saktar dramatiskt. De flesta skaka kolv kulturer också köras som ett parti, vilket innebär att de matas endast en gång vid eller nära början av kulturerna inoculation. Efter denna initiala kolkällan förbrukats avbryts odlingen växer. I vissa fall dess metabolism kan flyttas och börjar konsumera andra metaboliter i odlingsbuljongen, ibland som ändrar egenskaperna hos den resulterande biomassan eller protein. Skakflaskor är också oftast föremål för media avdunstning i varmare kulturmiljöer, normalt 10% av volymen per 24 timmar vid 37 ° C. Denna förlust ändrar densiteten hos kulturen och förbjuder långsiktiga driften av systemet. Slutligen kan användaren stöter skummande från media efter omröring. Förekomsten av skummet i det övre utrymmet ovanför kulturen kommer att begränsa gasutbyte och ytterligare dämpa tillväxten.
Grundjäsnings Systemet är utformat för att ta itu med alla dessa begränsningar. Noggrann temperaturstyrning uppnås i jäsningstankar genom användning av pumphjulet omrörning och en värmemantel. En sensor in i kärlet och återkoppling av uppvärmning och kylning av den här jackan brukarresulterar i temperaturreglering ± 0,1 ° C runt börvärdet. Stationär fermentorer ger i allmänhet kontroll av pH via flytande reagens förutom genom en pump. PH-värdet övervakas kontinuerligt i ett försök att hålla miljön optimal för celltillväxt. Korrekt luftning upprätthålles genom den tidigare nämnda blandnings impellern eller genom infusion av luft eller syre kompletterat gas direkt in i kulturen. Med skjuvkänsliga kulturer är syre kompletterat gas den primära mekanismen för upprätthållande av syrenivån i kulturen. Mätning av syre i lösning uppnås vanligen genom en polarografisk sond, som normalt inte är tillgängliga för användning i skakflaskor. Det är också möjligt att kontinuerligt eller med jämna mellanrum lägga foder till fartyget för att bibehålla tillväxt på ett linjärt eller exponentiellt sätt. Utträdes gas kondensor ger en kall yta för ånga i avgasflödet för att kondensera och därmed skydda kulturvolym och densitet. Periodisk tillsats av skumdämpare ytaktivt manövrerasav en konduktivitetssond i kulturen, minska skum på ytan och tillåter gasutbyte.
Fartyget, med alla givare, beslag, impellrar, skörd rör och slangar, monteras och steriliseras i en vanlig autoklav. Efter sista sond kalibreringar och stabilisering till omvärlden, är kulturen till kärlet. Systemet kan sedan användas för att karakterisera den kultur på ett sätt som är mer kvantitativt och exakt än med en skakkolv metod. Tät kontroll av temperatur, pH, syrehalt, foderförbrukning, vätskeavdunstning och skumnivåer bidrar till en mycket högre biomassa och bättre proteinutbytet.
Omröringstank bioreaktorer är standard inom bioteknikindustrin och har använts i över 40 år 1. Den lilla omröringstank har varit viktigt för uppskalning, skala ner, stam optimering, karakterisering, och processutveckling. Det kan också ha en viktig roll i utvecklingen av individualiserad medicin 2. Det småskaliga bioreaktorn är mest likt in situ-förhållanden för celltillväxt, eftersom den kan följas och optimeras under en körning. Oftast är inledande experiment utförs med skakflaskor men villkoren i den småskaliga bioreaktor skiljer sig avsevärt från skakkolven. I ett experiment, fann vi att villkoren för optimal tillväxt av E. coli och framställning av grönt fluorescerande protein (GFP) i skakflaska inte översätta till den omrörda tanken (opublicerade data).
Andra metoder för att odla celler i stor skala innefattar rullflaskor, enkel use gungande plattform bioreaktorer 3 och större engångs bioreaktorer med arbetsvolymer från 50 till 5.000 L. Varje metod ger utmaningar för uppskalning, men har funnit en plats i produktionen. Den enda användning gungande plattform bioreaktor liknar omröringstanken, och åstadkommer en reglerad miljö. Den skiljer sig från den omrörda tanken i att blandning uppstår på grund av en vaggande rörelse för att generera vågor för att förhindra cellsedimentering och tillhandahålla syresättning. De hydrodynamik för denna metod skiljer sig från den omrörda tanken och maximal volym är begränsad till 1000 L. Skillnaderna kan påverka celltillväxt och produktproduktion. Övriga engångssystem kombinerar den omrörda tanken med engångs reaktorn för att ge en plattform med ett minimum av infrastruktur och tillhörande overhead, och möjligheten för high-throughput bioprocessning 4.
Nya användare av stationär bioreaktorer kan ha problem att bestämma initiala börvärden för pH, PO2 och temperatur, men publicerad forskning kan refereras för denna information 5, 6, 7, 8, 9. Med bakteriekulturer i synnerhet, är det rekommenderat att starta omrörning vid samma hastighet som den skakkolv och temperaturen på samma börvärde. Kultur pH från tidigare skakkolvar körningar kan också användas som en startpunkt. Inställning av värdet Po 2 är svårare och är normalt bestämmas empiriskt. Men börjar med 50% PO2 är en rekommenderad startpunkt.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt var stöd delvis av Johns Hopkins University, kontoret för Provost genom Gateway Science Initiative.
Name | Company | Catalog Number |
LB broth | Sigma | L3022 |
ampicillin | Sigma | A1593-25G |
LB broth | Sigma | L3022 |
antifoam 204 | Sigma | A8311 |
1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |