Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Summary

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Abstract

Structurele en dynamische studies van G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) signalering complexen te vergemakkelijken, zijn nieuwe benaderingen nodig zijn om informatieve probes of labels introduceren in uitgedrukt receptoren die geen receptor functie niet verstoren. We gebruikten amber codon suppressie technologie genetisch coderen van het niet-natuurlijke aminozuur, p-azido-L-fenylalanine (azf) bij verschillende gerichte posities in GPCRs heteroloog tot expressie gebracht in zoogdiercellen. De veelzijdigheid van de azidogroep is hier weergegeven in verschillende toepassingen GPCR bestuderen in hun natieve cellulaire omgeving of in detergens gesolubiliseerde omstandigheden. Ten eerste tonen we een cel-gebaseerde gerichte fotoverknoping technologie aan de residuen in de ligand-bindingsplaats van GPCR wanneer een tritium-gelabeld kleine moleculen ligand verknoopt een genetisch gecodeerd aminozuur azido identificeren. We tonen dan plaatsspecifieke modificatie van GPCR's door de bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligatie reactiestie dat de azidogroep richt met behulp van fosfine derivaten. We bespreken een algemene strategie voor gerichte peptide-epitoop tagging van uitgedrukt membraaneiwitten in-cultuur en de detectie met behulp van een whole-cell-gebaseerde ELISA aanpak. Tot slot laten we AZF-GPCR selectief kan worden gelabeld met fluorescente probes. De methoden besproken algemeen, aangezien zij kunnen in beginsel worden toegepast op elk aminozuur positie in een GPCR tot expressie actieve signalering complexen ondervragen.

Introduction

Heptahelical G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) omvatten een superfamilie van zeer dynamische membraaneiwitten die belangrijk en diverse extracellulaire signalen mediëren. In het klassieke paradigma wordt receptoractivering gekoppeld ligand geïnduceerde conformatieveranderingen. ^{1, 2} hebben recente ontwikkelingen in de structurele biologie van GPCRs belangrijke inzicht in de moleculaire mechanismen van transmembraan signalering ontvangen. ^3-5 echter te begrijpen met een grotere nauwkeurigheid de chemische werkingsmechanisme en structurele dynamica van GPCR-signalering, is een toolkit van benaderingen nodig zijn om informatieve moleculaire en chemische probes te nemen aan actieve signalering complexen ondervragen.

Daarom passen wij een methode om plaatsspecifiek voeren niet of minimaal storende sondes in expressie receptoren gebaseerd op natuurlijk aminozuur (UAA) mutagenese met amber codon suppressie technologie eerder ontwikkeld door Schultz en coworkers. ⁶ We geoptimaliseerd de UAA mutagenese methode om een high-yield expressie en mutagenesesysteem voor eiwitten zoals GPCR's, die moeilijk uit te drukken in een andere dan de zoogdiercellen meeste heterologe systemen zijn te bereiken. Met behulp van een orthogonale gemanipuleerde suppressor tRNA en evolueerde aminoacyl-tRNA synthetase paar voor een specifiek UAA, we plaatsspecifiek geïntroduceerd UAAs in uitgedrukt doel GPCR's. De succesvolle integratie van UAAs, p-acetyl-L-fenylalanine (ACF), p-benzoyl-L-fenylalanine (BZF), en p-azido-L-fenylalanine (azf) is aangetoond in ons model GPCRs – rhodopsine en menselijke CC chemokine receptor CCR5. ^{7, 8}

In beginsel kan een UAA genetisch gecodeerd op elke positie in het eiwit sequentie en deze woning is een waardevol biochemische instrument omdat het zorgt voor single-codon scannen van een doel GPCR. We richten ons hier specifiek op de veelzijdigheid van de UAA, AZF, die een reactieve Azi heeftdo groep. Naast het dienen als een uniek infrarood (IR) sensor, ^{8, 9} azf kan ook dienen als een fotoactiveerbare verknoper door reactie met naburige primaire aminen of alifatische waterstofatomen. Bovendien kan het biologisch inerte azidogroep nemen als een selectief chemisch handvat bioorthogonal labelingsreacties. Hier laten we voorbeelden illustreren de nuttige toepassingen van plaats-specifieke incorporatie van AZF in GPCRs, zoals gerichte fotoverknoping te controleren een receptor-ligand-complex en modificatie van GPCR door bioorthogonal epitoop tagging en fluorescente labeling strategieën.

Fotoactiveerbare reagentia zijn gebruikt om biologische systemen te bestuderen sinds 1960. ¹⁰ In deze periode zijn een overvloed aan receptor-ligand verknoping experimenten gerapporteerd dat GPCR complexen studie, waarvan de meeste betrekking het gebruik van foto-affiniteit liganden. ^{11, 12} Echter, deze toepassingen zijn technisch beperkt, aangezien zij require synthese van liganden richting een verknopende groep. ^13-15 bovendien de crosslinker deel in het ligand, is het een uitdaging om de locatie van de verknoping bepalen de GPCR. Plaatsspecifiek introduceren fotoverknopende groepen UAAs in eiwitten met het amber codon onderdrukking technologie is een waardevolle vooruitgang. ^{16 17} We ontwikkelden een fotoverknoping techniek om de binding interface op een receptor die betrokken is bij de vorming van een receptor-ligand-complex te identificeren levende cellen door de invoering fotolabiele groepen in GPCR's. ^{18, 19} Hier beschrijven we de experimentele protocol en de wijze van data-analyse voor de toepassing van deze gerichte fotoverknoping technologie om de bindingsplaats van een klein-molecule ligand, tritiumhoudend maraviroc, op CCR5 identificeren. Deze werkwijze in op de precieze kwantificering van de radioactieve handvat op het ligand, naast behoud van de natuurlijke chemische structuur van het ligand.

Fluorescentie-gebaseerde technieken ondersteunen juist begrip van de structurele basis van receptoractivering door direct sonderen van de conformationele toestand van de receptor. ^{20, 21} echter technieken bezit de flexibiliteit om fluorescerende labels introduceren in GPCRs plaatsspecifiek beperkt. Wij zijn geïnteresseerd in het gebruik van bioorthogonal chemische modificatie strategieën om single-molecule detectie (SMD) van GPCR signalering complexen te vergemakkelijken. ²² De azidogroep kan deelnemen aan bioorthogonal chemicaliën zoals Staudinger-Bertozzi ligatie, ^{23, 24} kopervrije-stam bevorderd azide- alkyne cycloadditie (SpAAC) ²⁵ en-koper-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). ²⁶ Wij richten ons hier op de Staudinger-Bertozzi ligatie reactie die de specifieke reactie tussen een azide en een fosfine gaat. We demonstreren het gebruik van twee verschillende fosfine derivaten geconjugeerd aan een peptide epitoop (FLAG peptide) of een fluorescerend label(Fluoresceïne) naar plaatsspecifieke modificatie van GPCR's te bereiken.

We hebben eerder geoptimaliseerd voorwaarden voor plaats-specifieke labeling van rhodopsine AZF varianten met de röntgenbron kristalstructuur en dynamische simulaties doelplaatsen die aan oplosmiddel blootgestelde zijn kiezen. ^{27 28} We geïllustreerd tevens de mogelijkheid om zonder achtergrond labeling bereiken door Staudinger- Bertozzi ligatie. ²⁹ We tonen hier de algemene procedure gebruikt voor fluorescente labeling van een detergens gesolubiliseerde receptor die is geïmmobiliseerd op een matrix immuno vervolgens gevisualiseerd door in-gel fluorescentie bereiken. Daarnaast tonen we een nuttige uitbreiding op deze etikettering strategie om posities ontvankelijk voor etikettering op een receptor van onbekende structuur, CCR5 identificeren. Dit wordt uitgevoerd met een gerichte peptide-epitoop tagging strategie die is gebaseerd op bioorthogonal modificatie van AZF-GPCR varianten in een celgebaseerde semi-high throughput format. ³⁰ Ditmethode maakt gebruik van de multi-step detectie eigenschappen van een cel-oppervlak ELISA etikettering gebeurtenissen volgen.

De methoden die we hier besproken zijn algemeen en kunnen in principe worden toegepast op elk GPCR opgenomen met AZF met het amber codon onderdrukking technologie. In de hier gepresenteerde gedetailleerde weergave van de stappen die in zoogdiercellen expressie van receptoren opgenomen met UAAs zoals AZF met het onnatuurlijke aminozuur mutagenese werkwijze en de latere toepassingen structurele en dynamische studies van GPCRs vergemakkelijken protocollen.

Protocol

1. Site-specifieke genetische Oprichting van natuurlijke aminozuren in GPCR Handhaaf HEK293T cellen in DMEM (4,5 g / l glucose, 2 mM glutamine), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Transfecteren de cellen gekweekt tot 60-80% confluentie in een 10 cm plaat met behulp van Lipofectamine Plus reagens. Aan 750 ul DMEM, voeg 10 ul Plus reagens, 3,5 ug GPCR cDNA (pMT4. Rho of pcDNA 3.1. CCR5) bevattende amber stopcodon op een gewenste positie…

Representative Results

We gebruikten het onnatuurlijke aminozuur mutagenese methode voor plaatsspecifiek moleculaire probes introduceren in een GPCR volgens de amber codon onderdrukking technologie. De regeling in Figuur 1 schetst de voornaamste stappen van de methodologie en de verschillende toepassingen van het opnemen van de veelzijdige UAA, p-azido-L-fenylalanine (AZF), in GPCR's. Expressie van AZF-GPCR's in zoogdiercellen maakt het mogelijk gerichte fotoverknoping aan liganden, en gerichte peptide-epitoo…

Discussion

We beschrijven hier een robuuste methode voor plaatsspecifieke integratie van een reactieve probe, AZF, in GPCRs en tonen drie nuttige toepassingen van dit hulpmiddel om de structuur en dynamiek van GPCR bestuderen. Onze methode naar site-specifiek te nemen UAAs omzeilt een fundamenteel probleem met een alternatieve strategie op basis van chemisch labelen ^{32, 33} of vastmaken fotocrosslinkers ³⁴ tot een enkel toegankelijk cysteïne mutant. Hoewel chemische dat cysteïne thiol doelgroepen zijn gebrui…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials