Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Summary

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Abstract

Para facilitar os estudos estruturais e dinâmicas de G do receptor acoplado à proteína (GPCR) de sinalização complexos, novas abordagens são necessários para introduzir sondas informativas ou etiquetas em receptores expressos que não perturbam a função do receptor. Usamos âmbar tecnologia de supressão de codões para codificar geneticamente o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina (AZF) em várias posições orientadas nos GPCRs heterologamente expressos em células de mamíferos. A versatilidade do grupo azido é aqui ilustrado em diferentes aplicações para estudar GPCRs no seu ambiente celular nativo, ou sob condições de detergentes solubilizadas. Em primeiro lugar, nós demonstramos uma tecnologia de foto-reticulação com base nas células-alvo para identificar os resíduos no bolso de ligação ao ligando de GPCR em que um marcado com trítio pequena molécula ligante é reticulado com um ácido azido-amino geneticamente codificado. Nós, então, demonstrar a modificação específica do site de GPCRs pelo bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligadura reaçãoção que tem como alvo o grupo azido utilização de derivados de fosfina. Discute-se uma estratégia geral para o alvo de marcação de péptidos com epitopo das proteínas de membrana expressos em cultura e a sua detecção usando uma abordagem baseada em ELISA de célula inteira. Finalmente, mostra-se que AZF-GPCRs pode ser marcado selectivamente com sondas fluorescentes. As metodologias são discutidos em geral, na medida em que podem, em princípio, ser aplicada a qualquer posição do aminoácido em qualquer expressa GPCR para interrogar os complexos de sinalização activas.

Introduction

Heptahelical receptores acoplados à proteína (GPCRs) compreendem uma superfamília de proteínas de membrana altamente dinâmicos que medeiam sinais extracelulares importantes e diversas. No paradigma clássico, a activação do receptor é acoplada com alterações conformacionais induzidas pelo ligando. ^{1, 2} avanços recentes em biologia estrutural dos GPCRs têm fornecido uma visão significativa sobre os mecanismos moleculares da sinalização transmembrana. ^3-5 No entanto, para compreender com maior precisão o químico mecanismo funcional e dinâmica estrutural de sinalização GPCR, um kit de ferramentas de abordagens é necessária para incorporar sondas moleculares e químicas informativos para interrogar complexos de sinalização ativos.

Para este fim, nós adaptamos um método para o site especificamente introduzir não ou minimamente sondas perturbadores em receptores expressos com base no aminoácido não natural mutagênese (SAU), utilizando tecnologia de supressão de âmbar códon anteriormente iniciada por Schultz e coworkers. ⁶ Nós optimizado a metodologia mutagénese UAA para alcançar uma expressão de alto rendimento e um sistema de mutagénese de proteínas, tais como os GPCRs, que são difíceis de expressar em células de mamífero do que outros sistemas mais heterólogos. Usando um supressor de engenharia ortogonal tRNA e evoluiu aminoacil-tRNA sintetase par para uma SAU específica, local especificamente introduzido UAAs em GPCRs alvo expressas. A incorporação bem sucedida de UAAs, p-acetil-L-fenilalanina (AcF), p-benzoil-L-fenilalanina (BZF), e p-azido-L-fenilalanina (AZF) foi demonstrada no nosso modelo GPCRs – rodopsina e humano receptor de quimiocina CC, CCR5. ^{7, 8}

Em princípio, um UAA podem ser geneticamente codificado em qualquer posição dentro da seqüência de proteínas e esta propriedade é uma ferramenta bioquímica inestimável, pois permite que um único códon de varredura de um GPCR alvo. Nós nos focamos especificamente sobre a versatilidade da UAA, AZF, que tem um azi reativafazer metade. Além de servir como um (IR) da sonda original de infravermelhos, ^{8, 9} AZF pode também servir como um agente de ligação cruzada por fotoactivável reagir com aminas primárias ou hidrogénios alifáticos vizinhos. Além disso, o grupo azido biologicamente inertes podem participar como pega química seletiva em reações de rotulagem bioorthogonal. Aqui apresenta-se exemplos que ilustram as aplicações úteis de incorporação específica do local de AZF em GPCRs, tais como o fotocruzamento alvo para interceptar um complexo receptor-ligando, e a modificação dos GPCRs por marcação de epitopo bioorthogonal e estratégias de marcação fluorescente.

Fotoactiváveis ​​reagentes foram utilizados para estudar sistemas biológicos desde os anos 1960. ¹⁰ Neste período, uma abundância de experiências de reticulação ligando-receptor foram relatados para estudar os complexos de GPCR, a maioria dos quais envolve a utilização de ligantes de fotoafinidade ^{11, 12} No entanto, estes. aplicações são tecnicamente limitados, uma vez que require a síntese de ligandos que possuem um grupo de reticulação ^13-15. Além disso, com a porção de agente de ligação cruzada no ligando, isto é difícil de identificar a localização da ligação transversal na GPCR. Site-especificamente a introdução de grupos de fotorreticulação como UAAs em proteínas utilizando o codão âmbar tecnologia de supressão é um avanço valioso ^{16, 17.} Desenvolvemos uma técnica de foto-reticulação para identificar a interface de ligação a um receptor que está envolvida na formação de um complexo receptor-ligando em vivo através da introdução de grupos de células em fotolábeis GPCRs. ^{18, 19} Aqui, descrevemos o protocolo experimental e método de análise de dados para aplicar esta tecnologia fotorreticulação alvo para identificar o local de ligação de um ligando de molécula pequena, maraviroc tritiada, em CCR5. Este método aproveita a quantificação exacta do identificador radioactivo no ligando, para além de manter a estrutura química nativa do ligando.

Técnicas baseadas em fluorescência apoiar a compreensão precisa da base estrutural da activação do receptor por sondando directamente o estado conformacional do receptor. ^{20, 21} No entanto, as técnicas que possuem a flexibilidade de introduzir marcadores fluorescentes em GPCRs local especificamente são limitados. Estamos interessados ​​em empregar estratégias de modificação química bioorthogonal para facilitar a detecção de moléculas individuais (SMD) de GPCR complexos de sinalização. ²² O grupo azido podem participar químicas bioorthogonal como Staudinger-Bertozzi ^{ligadura, 23, 24} azida-promovido-deformação sem cobre cicloadição alcino (SpAAC) ²⁵ e azida-alcino cicloadição catalisada por cobre (CuAAC). ²⁶ Nós nos focamos na reação ligadura Staudinger-Bertozzi, que envolve a reação específica entre uma azida e uma fosfina. Nós demonstramos a utilização de dois derivados diferentes de fosfina, conjugados com um péptido epitopo (péptido FLAG) ou uma etiqueta fluorescente(F luoresceína) para conseguir a modificação específica do local de GPCRs.

Nós já otimizada as condições para a rotulagem específica do site da rodopsina AZF variantes usando a estrutura de cristal de raio-X e simulações dinâmicas para escolher os locais alvo que são expostos solvente. ^{27, 28} Também ilustrou a viabilidade de alcançar rotulagem sem fundo por Staudinger- bertozzi ligadura. ²⁹ Demonstramos aqui o procedimento geral empregue para alcançar marcação fluorescente de um receptor de detergente solubilizado que é imobilizado sobre uma matriz de imunoafinidade e posteriormente visualizados por fluorescência em gel. Além disso, nós demonstramos uma extensão útil sobre esta estratégia de rotulagem para identificar posições passíveis de rotulagem em um receptor de estrutura desconhecida, CCR5. Esta é levada a cabo usando uma estratégia de marcação péptido epitopo específico, que se baseia na modificação bioorthogonal de AZF-GPCR variantes em um formato semi-alto rendimento com base em células. ³⁰ Estemétodo explora as propriedades de detecção multi-passo de um ELISA da superfície celular para monitorar eventos de rotulagem.

As metodologias que discutimos aqui são gerais e, em princípio, pode ser aplicado a qualquer GPCR incorporado com AZF usando o âmbar códon tecnologia de supressão. Nos protocolos apresentados aqui pormenorizadamente as etapas envolvidas na expressão das células de mamíferos de receptores incorporados com UAAs como AZF utilizando o método de mutagénese de aminoácido não natural e seus pedidos subsequentes para facilitar os estudos estruturais e dinâmicas de GPCRs.

Protocol

1. Site-specific Constituição genética de Unnatural Aminoácidos em GPCRs Manter células HEK293T em DMEM (4,5 g / L de glicose, glutamina 2 mM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. Transfectar as células cultivadas a 60-80% de confluência numa placa de 10 cm usando o reagente Lipofectamine Plus. Para 750 mL de DMEM, adicionar 10 ul de reagente Bonés, 3,5 ug de cDNA de GPCR (pMT4. Rho ou pcDNA 3.1. CCR5) contendo o codão de …

Representative Results

Utilizamos a metodologia de mutagênese aminoácido não natural para o site especificamente introduzir sondas moleculares em um GPCR usando o âmbar códon tecnologia de supressão. O esquema da Figura 1 esboça os passos salientes da metodologia e os vários pedidos de incorporar o versátil UAA, p-azido-L-fenilalanina (AZF), para GPCRs. Expressão da AZF-GPCRs em células de mamíferos permite fotoreticulação alvejado a ligantes, e marcação peptídeo epítopo ou modificações fluorescen…

Discussion

Descrevemos aqui uma metodologia robusta para incorporação site-specific de uma sonda reativa, AZF, em GPCRs e demonstrar três aplicações úteis deste instrumento para estudar a estrutura ea dinâmica de GPCRs. Nosso método para o site especificamente incorporar UAAs contorna um problema fundamental com uma estratégia alternativa baseada na rotulagem quimicamente ^{32, 33} ou anexar photocrosslinkers ³⁴ para um único mutante cisteína acessível. Embora, químicos que têm como alvo grupos tio…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials