यहाँ हम प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय का उपयोग करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट<em> Δku80</emके> उपभेदों<em> Toxoplasma gondii</em> कुशलतापूर्वक कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए लक्षित जीन विलोपन और जीन प्रतिस्थापन उत्पन्न करने के लिए.
Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The Δku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The Δku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II Δku80Δhxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in Δku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).
Toxoplasma gondii कि अक्सर एक आम लाचार इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोआ परजीवी है और लंबे समय से पशुओं और मनुष्यों 5 की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित करता है. यह इस रोगज़नक़ द्वारा अधिक से अधिक 1 अरब मनुष्य है कि वर्तमान में अनुमान लगाया गया है और लंबे समय से संक्रमित है. टी. के कारण बीमारी के महत्व के अलावा इन विट्रो विकास और उत्कृष्ट माउस मॉडल में टी. बना दिया की gondii संक्रमण, प्रयोगात्मक उपकरण, शक्तिशाली जीनोमिक्स संसाधनों 6 की बढ़ती उपलब्धता, आसानी gondii इंट्रासेल्युलर यूकेरियोटिक रोगजनकों और इस तरह के मलेरिया (प्लाज्मोडियम सपा.) और Cryptosporidiosis (क्रिप्टोस्पोरिडियम) 5,7 के रूप में घातक रोगों का कारण है कि अन्य महत्वपूर्ण Apicomplexan परजीवी के व्यापक अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल प्रणाली. एक मॉडल के रूप में जीव Toxoplasma gondii का एक महत्वपूर्ण सीमा आनुवंशिक जोड़तोड़ लक्षित ले कि संतान के अकुशल वसूली की गई है. इस समस्याओं केजीन लक्ष्यीकरण में मीटर टी. के जंगली प्रकार उपभेदों में nonhomologous पुनर्संयोजन की बहुत उच्च आवृत्ति के सापेक्ष मुताबिक़ पुनर्संयोजन के एक कम आवृत्ति की वजह से है व्यापक डीएनए अनुरूपता आनुवंशिक अध्ययन 2 में इस्तेमाल किया डीएनए अणु लक्ष्य में प्रदान की जाती है gondii भी जब.
हमने हाल ही में आनुवंशिक प्रकार में nonhomologous पुनर्संयोजन के प्रमुख मार्ग अवरुद्ध, KU80 प्रोटीन 1,2 एन्कोडिंग जीन को हटाने से मैं और प्रकार द्वितीय Toxoplasma gondii के उपभेदों. मैं और प्रकार द्वितीय Δ KU80 उपभेदों सामान्य विकास दर, आकार और इन विट्रो में और vivo में इन विट्रो में tachyzoite और bradyzoite चरणों के दौरान और इन विवो में दोनों व्यवहार प्रदर्शित परिणामस्वरूप प्रकार, हालांकि, इन उपभेदों अनिवार्य रूप से एक 100% मुताबिक़ पुनर्संयोजन की आवृत्ति और इस प्रदर्शन फेनोटाइप कई यद्यपि करने के लिए कई सौ द्वारा लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ की तेजी अलग इच्छित संतान की संभावना बढ़ जाती हैUSand गुना 1,2,4. हाल के समुदाय चौड़ा मैं और प्रकार द्वितीय Δ KU80 उपभेदों गति काफी ramped है प्रकार के उपयोग, विविधता, साथ ही टी में लक्षित आनुवंशिक दृष्टिकोण की सफलता दर gondii 1-4,8-13. यहाँ हम टी. के Δ KU80 उपभेदों में लक्षित जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन, और जीन टैगिंग के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन gondii. हम डिजाइन और मज़बूती से Toxoplasma gondii की Δ KU80 उपभेदों में विशिष्ट जीन या आनुवंशिक loci के लिए आनुवंशिक जोड़तोड़ लक्षित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.
यहाँ हम लक्षित जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन, और / या टैग किए गए जीन के अधिकारी है कि आनुवंशिक रूप से चालाकी से संतान के कुशल वसूली को सक्षम करने Δ KU80 परजीवी उपभेदों में लक्षित कुशल जीन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इन तरीकों में से अनुक्रमिक निष्पादन 1-3 एकल या एकाधिक लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ होते हैं कि परजीवी म्यूटेंट के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. एक लक्षित हटाए जाने की पीढ़ी के कई कारकों पर निर्भर करता है, प्रस्तुत रणनीति और प्रोटोकॉल के साथ Δ KU80 तनाव का उपयोग बहुत टी. की ठीक से परिभाषित उत्परिवर्ती उपभेदों बनाने की दक्षता और आराम बढ़ जाती है कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के लिए gondii.
टी. के जीनोम अलैंगिक चरणों के दौरान gondii अगुणित है. इस प्रकार एक जीन को हटाने के लिए योजना बनाते समय बनाने के लिए एक विचार जीन इन विट्रो में आवश्यक नहीं होना चाहिए. बहरहाल, targe की दक्षताΔ KU80 उपभेदों में टिंग जीन knockouts के अत्यंत उच्च है, और यह काफी बिगड़ा हुआ प्रतिकृति दरों के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. एक लक्षित जीन आवश्यक है, परजीवी अक्सर चयन के दौरान दोहराने के लिए संघर्ष. लक्षित आनुवंशिक हेरफेर में एक अन्य महत्वपूर्ण कारक जीनोमिक को लक्षित ओर से कम से कम 620 बीपी पता लगाने योग्य लक्षित एकीकरण 2 को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है के साथ कि सही समरूपता है. अनुरूपता की लंबी क्षेत्रों को लक्षित और लगभग 1,000 बीपी के डीएनए किनारों को लक्षित 1-4 एक विश्वसनीय और कारगर तरीका है का उपयोग करने की उच्च क्षमता का उत्पादन. इस कारण यह जीनोमिक लक्षित कर फ्लैंकों टी. का एक ही तनाव से उत्पन्न कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है आनुवंशिक रूप से चालाकी से किया जा रहा है कि तनाव के रूप में gondii (आरएच, प्रु). पर्याप्त अनुरूपता की कमी अक्सर एक जीनोमिक को लक्षित ओर से लक्षित एकीकरण का परिणाम है, लेकिन दूसरे नहीं कर सकते हैं. अधूरा एकीकरण या एक पीटा मा प्राप्त करने के लिए विफलतावाई भी episomal हठ की वजह से हो. इसके तत्काल बाद अभिकर्मक के बाद, को लक्षित अणुओं के सभी episomes nonintegrated कर रहे हैं, और कभी कभी को लक्षित अणुओं कई पीढ़ियों के लिए episomes के रूप में बच सकते हैं. ~ 1 KBP का लक्ष्य डीएनए किनारों का प्रयोग और पूर्व फिर से subcloning के लिए चयन के तहत परजीवी पारित करने के लिए जारी रखने के लिए अक्सर episomal दृढ़ता के साथ जुड़ी समस्याओं को हल करता है.
एक पीटा मान्य है और HXGPRT मार्कर हटा दिया जाता है एक बार, जीन को निशाना बनाने की रणनीति 1-3 एक परजीवी तनाव में एकाधिक जीन विलोपन उत्पन्न करने के लिए एक दूसरा भारत सरकार पर दोहराया जा सकता है. विलोपन, प्रतिस्थापन, या टैग किए गए जीन की पीढ़ी भी अलग चयन मार्कर (bleomycin, कैट, pyrimethamine प्रतिरोधी DHFR, आदि) का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है. कैट चयन मार्कर वर्तमान प्रकार द्वितीय Δ KU80 प्रु जीनोम 1 में मौजूद है, हालांकि, इस मार्कर HXGPRT का उपयोग कर हटाया जा सकता है </उन्हें> चयन प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है. हमारे हाथ में, HXGPRT चयन एक एकल प्रतिलिपि लक्षित प्रविष्टि एमपीए + एक्स मध्यम. HXGPRT में मजबूत चयन के लिए पर्याप्त है, जहां सबसे अधिक लक्षित कर कुशलता के साथ सुरक्षित और सबसे कुशल मार्कर है भी एक के लक्षित हटाने के लिए केवल वर्तमान में उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करता है 6 thioxanthine (6TX) चयन 2,3 का उपयोग कर चयन मार्कर (चित्रा 3). इस प्रकार इस प्रोटोकॉल कई लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ परिभाषित उत्परिवर्ती उपभेदों के विकास के लिए केवल वर्तमान दृष्टिकोण प्रदान करता है.
इस प्रोटोकॉल Toxoplasma gondii की Δ KU80 उपभेदों में लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक मूल्यवान और कुशल तरीका प्रदान करता है और एक जीन, जीन के एक परिवार, या जीनोम चौड़ा कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के विश्लेषण के लिए लागू है. पिछले Δ KU80 उपभेदों 1,2 की उपलब्धता के लिए, इन तरीकों ine के कारण व्यापक रूप से व्यवहार्य नहीं थेइन तरीकों में से fficiency. नतीजतन, इस प्रोटोकॉल Toxoplasma gondii के लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए व्यापक रूप से लागू है और परजीवी जीव विज्ञान, मेजबान प्रतिक्रिया, और कार्यात्मक जीनोमिक्स पर सवालों की एक श्रृंखला के समाधान में रुचि रखते सभी जांचकर्ताओं के लिए सुलभ है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम में दिल्ली जल बोर्ड के लिए एनआईएच से अनुदान (AI041930, AI073142, AI075931, और AI091461) द्वारा समर्थित किया गया था.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Overlap Primers | Integrated DNA Technologies | 4 nmole Ultramer DNA oligos | |
Validation Primers | Integrated DNA Technologies | 100 nmole DNA Oligo | |
Yeast Strain #90845 | ATCC | Designation FY834 | |
Shuttle Vector pRS416 | ATCC | 87521 | |
DH10B E. coli | Invitrogen | 12033-015 | SOC broth in kit with E. coli |
Resuspension Buffer | Qiagen | Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit | |
Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
Glass Beads | Scientific Industries | SI-BG05 | 0.5 mm acid-washed |
Qiacube Automated Robotic Work Station | Qiagen | ||
Electroporation Cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | 2 mm-gap |
BTX600 electroporator | BTX | ||
Maxiprep Kit | Qiagen | 12662 | QIAprep Spin Maxiprep Kit |
25 cm2 Canted neck plug seal flask | Corning | 430168 | |
150 cm2 Canted Neck plug seal flask | Corning | 430823 | |
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | ATCC | SCRC1041 | |
Swin-lok Filter Holder | Whatman | 420200 | 25-mm-diameter |
Membrane | Whatman | 110612 | Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter |
Mycophenolic acid (MPA) | Sigma | ||
Xanthine (X) | Sigma | ||
96-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
24-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
MEM Eagle Media | Lonza Biowhittaker | 12-611F | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-111 | |
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti) | Gibco | 15240-062 | |
Spin Column | Primm Labs | PAE-100 | Easy Clean DNA Extraction Spin Kit |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | ||
6-thioxanthine | Acros Organics | ||
Tissue DNA Minikit | Qiagen | 51104 | QIAamp DNA Blood Mini Kit |
Cell Culture Freeze/Recovery Media | Gibco | 126-48-010 | |
Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30028.02 | minus calcium, minus magensium |