Ett. Riktad genmodifiering för att ta bort en gen av intresse Detta protokoll är utformad för effektiv generering av en mutant stam som har en riktad gendeletion vid en definierad genetiskt lokus. Den tidigare beskrivna T. gondii hypoxantin-xantin-guaninfosforibosyltransferas (HXGPRT) valbar markör används i detta protokoll för säker och tillförlitlig markör insättning efter mykofenolsyra och xantin (MPA + X) val 14-16. Detta protokoll använder en validerad och kostnadseffektiv metod för att konstruera DNA-målsökande molekyler baserade på jäst rekombinationskloning 17,18. Flera alternativa protokoll är kommersiellt tillgängliga för konstruktion av rekombinanta målsökande molekyler genom att använda bakteriella rekombinationskloning metoder, in vitro-rekombinatoriska kloningsmetoder, eller fusion PCR. Protokollet som beskrivs nedan ger högsta totala effektivitet och tillförlitlighet återvinna klonade punkternaiter som har en riktad gendeletion i Δ Ku80 stammar av T. gondii. 1.1 Beredning av targeting DNA Tillgång ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) för att erhålla genomiska sekvenser för genen av intresse (GOI). Obs: Genomiska sekvenser bör erhållas från typ I, II eller III-genomen sekvens i ToxoDB databas som är närmast stammen manipuleras. Till exempel: GT1 för RH och ME49 för Pru. Design specifika överlappande primrar som amplifierar 5 'och 3' genomiska riktade flanker av genen av intresse (GOI) som innehåller en 33 bp överlappning med jästskyttelvektorn pRS416 (eller alternativt pRS426) och införliva en 33 bp överlappning med den selekterbara markören ( HXGPRT) (fig. 1A-B). Lägg ett unikt restriktionsenzymställe i varje primer vid båda ändarna av den 5 'ennd 3 'genomiska riktade flanker, placerade mellan 33 bp överlappning och T. gondii-specifik primersekvens (er) (fig. 1A-B). Anmärkning: En större än 30 bp överlappning krävs för effektiv jäst rekombination kloning. De 5 'och 3' genomiska inriktning flanker är utformade för att amplifiera specifika DNA-fragment mellan 800 och 1400 bp som definierar en riktad deletion. Var medveten om att kortare flankerna avsevärt kommer att minska inriktning effektivitet i Δ Ku80 Δ hxgprt bakgrund 2. PCR amplifiera 5'mål flanken med användning av primers F1 och R1, och PCR-amplifiering av 3'-mål-flanken med användning av primer F2 och R2 (figurerna 1A-C) från genomiskt DNA 3. Separat PCR amplifiera ~ 2 Kbp HXPGRT genen innefattande den tillhörande 5-och 3'-dhfr-flankerande regioner av HXGPRT cDNA pminiHXGPRT kassett 14 med användning av primrarna HXF och HXR(Figurerna 1B-C). Obs: Amplify mål flankerna med genomisk DNA från moderstammen skall transfekteras. Obs! Sätt HXGPRT markör i den främre orientering i förhållande till 5 'och 3' DNA targeting flanker att underlätta påföljande effektiva genetiska manipulationer, såsom riktad avlägsnande av HXGPRT från den sönderdelade lokuset. Verifiera korrekta PCR-produktstorlekar genom agarosgelelektrofores och uppskatta koncentrationen DNA-fragmentet med hjälp av agarosgel-standarder eller annan metod för bestämning av DNA-koncentration. Generera kompetenta jäst portioner som beskrivs i Gietz och Schiestly 17. Kombinera 50 ng av 5 'genomiska targeting flank, 50 ng av 3' genomiska targeting flank, 100 ng HXGPRT selektionsmarkör, och 50 ng av linjäriserad skyttelvektor med sterilt H2O för att uppnå en slutlig volym av 10 -20 | il. Transformera kompetenta jäst med de tre PCR-produkter och jäst-E. coli-skyttelvektor för rekombinatorisk kloning med användning av protokollet som beskrivs av Gietz och Schiestly 17. Plate transformerade jästen på uracil-minus minimalplattor medelstora agar och inkubera vid 30 ° C i 2 – 3 dagar. Obs: Den ordnade montering av plasmiden, den 5 "mål flanken, den HXGPRT markör, och 3'-mål-flanken underlättas av de konstruerade 33 bp överlappning mellan DNA-fragment (fig. 1A-B) och förmedlas av homolog rekombination i jäst. Harvest jäst genom att tillsätta 2 ml av 2x YPAD till uracil-minus plattor och försiktigt skrapa för att driva bort kolonier utan att störa agar. Centrifugera jästen lösningen i 5 min vid 5000 xg och kassera supernatanten. Resuspendera jästen pelleten i 250 | il av en resuspension buffert innehållande RNasA och tillsätt 50-100 pl av encid-tvättade glaspärlor till lösningen. Vortex under 5 minuter på högsta hastighet för att krossa jästcellerna. Låt glaspärlor för att sedimentera till botten av röret och för över supernatanten till ett 2 ml Eppendorf-rör. Isolera jäst-DNA med användning av en miniprep kit DNA-isolering, återsuspendering i en slutlig volym av ~ 100 | il. Blanda 2 pl jäst-DNA (~ 50 ng) med 40 pl DH10B elektroporation kompetent E. coli hålls på is. Överför lösningen till en kyld 2 mm gap elektroporationskuvett och electroporate bakteriecellerna på 2,4 kV och 129 Ω. Rescue celler genom tillsats av 0,8 ml SOC buljong till varje kyvett och överföra lösningen till en 14 ml snap-cap Falcon rör. Inkubera cellerna vid 37 ° C på en vals trumma för 40 – 60 min. Plate E. coli på 2xYT + ampicillin (AMP)-plattor och inkubera plattorna vid 37 ° C över natten. Välj ~ 6 – 8 enstaka kolonier och växa i 3 ml 2XYT + AMP för ~ 16 timmar vid 37 ° C. <li> Bered en 30% lager glycerol frys för varje E. coli klon. Isolera plasmiden pΔGOI från E. coli-kloner med användning av en miniprep kit, återsuspendering i en slutlig volym av ~ 100 | il. Validera pΔGOI med restriktionsenzym smälter för att mäta DNA-plasmid storlek och verifiera den förväntade pΔGOI DNA banding mönster. Finalize validering av pΔGOI genom DNA-sekvensering av 5'-och 3 'genomiska riktade flanker att kontrollera 100% DNA-sekvens baserad på data genomsekvens i http://www.ToxoDB.org . Obs: Nära perfekt sekvenshomologi är viktigt för att maximera genmålstyrning effektivitet 3 eftersom varje baspar skillnad utgör ett motsvarande snitt i längd perfekt homologi. Anmärkning: genomsekvens av typ II Δku80 stammen baserad på Pru föräldra stregn är inte tillgänglig just nu. Detta arbete använder typ II ME49 genomet sekvens som surrogat genomet för typ II Δ Ku80 stammen. Baserat på sekvensdata vid ett antal genetiska lokus, uppskattas det att ME49 genomet och Pru genomet uppvisar singelnucleotidepolymorphisms med en frekvens av ~ 1 per 10.000 nukleotider, eller mindre. Generera> 200 pg pΔGOI lager genom att ympa en ~ 250 ml 2XYT + AMP övemattsodling med glycerol lager från en validerad E. coli miniprep klon. Isolera pΔGOI plasmid-DNA från den stora kulturen med hjälp av en maxiprep kit DNA-isolering, återsuspendering i en slutlig volym av ~ 1000 il. Upprepa restriktionsenzym klyvningar, eller DNA-sekvensering av pΔGOI maxiprep DNA för att verifiera korrekt målsöknings-DNA-molekylen före transfektion. Linjärisera ~ 15 ^ g pΔGOI vid 5'-änden med användning av den unika restriktionsenzymet X (RE.X)digest webbplats inbyggd i 5 "mål flanken (figur 1B). Obs: genmålsökning i T. gondii kräver minst ~ 10 ^ g av målsöknings-DNA för att erhålla en effektiv frekvens på målinriktning evenemang på genlocus av intresse 2. Verifiera linjärisering av pΔGOI och bestämma DNA-koncentrationen genom agarosgelelektrofores eller en alternativ metod. Obs: Om restriktionsenzymdigerering vid 5'flanken inte ger fullständig linjärisering, den designade 3 'kan unika RE.Y digest webbplats kan användas som en alternativ plats för linjärisering av pΔGOI. Obs: En helt linjär inriktning DNA-molekylen är avgörande för framgångsrik genmålinriktning genom homolog rekombination i Δ Ku80 stammarna. Neutralisera restriktionsenzymet genom incubatning vid 68 ° C under 15-20 min. Bered minst 15 ^ g av lineariserad plasmid i 100 | il sterilt H2O Store lineariserad pΔGOI vid -20 ° C tills tiden för transfektion. 1.2 Beredning av T. gondii parasiter, transfektion, urval, subkloning, validering, arkiv och underhåll av genetiskt manipulerade stammar Allmänna metoder för odling och manipulation av T. gondii i mänskliga (HFF) förhudsfibroblast celler beskrivs 19-21. De Δ Ku80 Δ hxgprt stammar replikera normalt i parasitinfektion medium (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) tillväxtmedium kompletterat med 1% fetalt bovint serum (FBS) och 1% Antimykotika-Antibiotikum utspädd från en 100x lager) 1,2. Allt arbete med Toxoplasma gondii utföras med skyddsnivå 2 förfaranden. T. gondii RHΔ Ku80 2 parental stammen genererades från RHΔ hxgprt stammen från Roos Lab 14. Den PruΔku80 en moderstammen genererades från PruΔhxgprt (Pru gniaud stam BSG-4 22) som innehåller en stabilt integrerad CAT selekterbar markör och ett grönt fluorescerande protein (GFP) reporter under kontroll av den bradyzoite stadiet specifika promotorn LDH2. Inokulera en 25 cm 2 kolv innehållande sammanflytande HFF-celler med 1 x 10 6 livskraftig typ I RH Δ Ku80 Δ hxgprt parasiter, eller inokulera två 25 cm 2 kolvar med 2 x 10 6 livskraftig typ II Prugniaud (Pru) Δ Ku80 Δ hxgprt parasiter. Obs: Livskraftiga parasiter definieras som extracellulära parasiter som nyligen har lyserade ut. Anmärkning: </strong> Denna skala ger ett tillräckligt antal livsdugliga parasiter för tre transfektionsexperiment. Inspektera Δ Ku80 Δ hxgprt infekterade kulturer ~ 68-72 timmar efter infektion. Kontrollera förekomsten av livskraftiga parasiter och ~ 90 – 95% lys av HFF-celler för att planera den exakta tidpunkten för transfektion. Obs: Isoleringen av nyligen egressed parasiter är avgörande för att lyckas med detta protokoll eftersom låg parasit lönsamheten kommer att avskaffa gen-targeting effektivitet. Rör om livsdugliga parasiter i lösning genom att stänga propp lock på 25 cm 2 kolv och kraftfullt skaka kolven fram och tillbaka att röra om parasiter bort av tillväxtytan utan stänk vätska på insidan av locket eller kolvens hals . Obs: Parasit skörd kräver inte en spruta-nål frisättning protokoll för typ I ellerTyp II Δ Ku80 stammar. Överför parasiten lösningen till en 10 ml spruta fäst till en filterhållare innehåller en 3 ^ m membran och placera filterenheten ovanpå en öppen 15 ml skruvkork rör. Sprutfilter parasiter in i 15 ml skruvkork rör. Obs: Filtrering parasiterna genom membranet avlägsnar infekterade celler och cellulära skräp. Bestäm parasiten koncentration (tachyzoite blanketter per ml) med hjälp av en hemocytometer. Obs: Valfritt: Använda parasiten lösningen, inrätta en plackbildande enhet (PFU) analys 21 som kommer att läsas 7 – 8 dagar senare för att bestämma lämplig bärkraft de transfekterade parasiter (PFU att tachyzoite förhållande ≥ 0,2). Pellets parasiter för 7 min vid 1400 xg och aspirera supernatanten till ~ 0,4 ml utan att störa parasiten pelleten. Spin i 2 min vid 1,400 xg och aspirera återstående supernatanten till ~ 0,01 ml utan att störa parasiten pelleten. Resuspendera pelleten parasit genom att ställa botten av röret och omedelbart lägga cytomix 23 buffert (1.33x koncentration) på parasitens pelleten för erhållande av en parasit koncentration av 4-5 x 10 7 parasiter / ml cytomix. Notera: Utelämna tillsats av ATP och glutation till cytomix eftersom dessa tillägg inte effektivisera genmålsökning. Tina 100 | il alikvot av den linjäriserade pΔGOI från protokoll 1,1 (steg 26). Överför 0,3 ml av parasiten cytomix lösning (~ 1,3-1,6 x 10 7 parasiter) till 100 | il av linjäriserad pΔGOI från protokoll 1,1 (steg 26), och omedelbart överföra hela 0,4 ml parasit + pΔGOI blanda till en kyld 2 mm spalt elektroporeringskyvett. Electroporate parasiterna på 1,4 kV och 24 Ω. Rest transfektion kyvett vid rumstemperatur i ~ 5 minuter sedan överföra hela innehållet i transfektion kyvetten i en 150 cm 2 kolv innehållande sammanflytande HFF-celler med 30 ml infektion medelstora och inkubera den infekterade kulturen över natten. Börja selektion i mykofenolsyra + xantin (MPA + X) ~ 20 h efter transfektion (fig 2A) genom att ersätta infektion mediet med MPA + X selektionsmedium (MPA (25 | ig / ml) och xantin (50 | ig / ml) i infektion medium). Obs: Inte störa inkubera MPA + X urval kolv. Uppskatta det totala antalet PFU i MPA + X urval kolv ~ 8 dagar efter transfektion genom visuell inspektion monoskiktet. Kontrollera att det finns att utveckla PFU och friska zoner av infektion med ljusmikroskop. Obs: Om plack inte syns vid dag 8, upprätthålla urval och skärmen för tecken på smittaion sedan muterade stammar kan ha en reducerad replikering takt. Anmärkning: De Δ Ku80 Δ hxgprt parasitstammar har en extremt låg bakgrund av oönskade icke-målbestämd händelser, vilket möjliggör den framgångsrika isoleringen av mutanta stammar med ganska svår, men inte letala defekter tillväxt. Om en gen är viktig och det kan inte tas bort, det primära transfektion, eller senare passerade parasit befolkningen, kan avslöja en fenotyp där parasiterna upphör att replikera under valet som befolkningen beslutar att riktade knockouts. Skaka kolv som i steg 3 för att driva bort extracellulära parasiter från monolagret [efter synliga plack har utvecklat] för att generera en parasit lösning. Överför ~ 0,5 ml av parasiten lösningen från MPA + X val kolven till en 25 cm 2 MPA + X urval kolv innehållande sammanflytande HFF-celler (utse denna 1A kultur pass). Få bort parasits i de ursprungliga 150 cm 2 MPA + X urval kolv ~ 3 dagar senare och överföring ~ 0,5 ml parasit lösning till en andra 25 cm 2 MPA + X urval kolv innehållande sammanflytande HFF-celler (utse denna 1B kultur pass). Tillåt zoner infektion utvecklas i Pass 1A och / eller passera 1B kolvar för ~ 5 dagar. Visuellt kontrollera genom Ijusmikroskopi som passerar 1A och kolvar 1B innehåller ett minimum av 25 livsdugliga PFU med friska zoner av infektion. Välj antingen pass 1A eller pass 1B kolv för fortsatt passage i MPA + X selekteringsmedium i 25 cm 2 kolvar. Behåll passage under MPA + X urval. Obs: Parasiter måste odlas för ett tillräckligt antal generationer att radera icke-integrerade kvarstående episomer från befolkningen före subkloning. Utför inte subkloning före till 20 dagar efter transfektion för typ I RH Δ Ku80 Δ hxgprt, eller före 25 dagar efter transfektion förtyp II Pru Δ Ku80 Δ hxgprt parasiter att ge tillräcklig tid för att späda icke-integrerade episomer 1,2. Subklon parasiter i en platta med 96 brunnar innehållande konfluenta HFF-celler med MPA + X selektionsmedium. Förbered en bricka i en koncentration av 1 parasit / brunn och ett andra fack vid en koncentration av 2 parasiter / brunn. Obs: subklonen parasiter som nyligen har lyserade (~ 90 – 95% av HFF-celler i 25 cm 2 kolv) för att se till att parasiterna har hög lönsamhet. Anmärkning: Den optimala tidsramen efter transfektion för subkloning fastställdes genom att mäta hur snabbt framgångsrikt riktade parasiter uppstår vid en hög frekvens i den valda populationen 1. Fortsätt att passagen den primära populationen av transfekterade parasiter i MPA + X selekteringsmedium med en veckovis passage schema att infekteraen 25 cm 2 HFF kolv med 10 ìl av parasiten lösningen. Obs: Om kloner som bär den riktade gendeletionen (knockouts) inte erhålls från den första subkloning i steg 18, resubclone parasiterna från kontinuerligt underhållas populationen ~ 10 – 12 veckor efter transfektion. Anm: En av orsakerna en gendeletion erhålls inte härrör från den episomala persistens av vissa pΔGOI plasmider. Episomal uthållighet bestäms av de sekvenser som finns i 5 'och 3' genomiska riktade flanker och verkar inte uppstå ur HXGPRT genetiskt element. Ungefär 5 – 10% av riktade plasmider uppvisar betydande episomal uthållighet som kräver en senare tidpunkt för subkloning att tillåta parasiten befolkningen ett tillräckligt antal generationstider att späda de ihållande episomer och lösa befolkningen huvudsakligen stabila integranter. <ol start = "20"> Betyg den 96-brunnar 6-7 dagar efter subkloning (typ I parasiter) eller 7-8 dagar efter subkloning (typ II parasiter) för brunnar som innehåller ett enkelsträngat PFU, identifierad som en enda zon av infektion i Ijusmikroskopi vid antingen 40X eller 60X makten. Markera en liten prick på 96-brunnar lock för att beteckna placeringen av PFU i brunnen. Blanda innehållet i varje brunn innehållande en enda PFU användning av en pipett inställd på 50 | il (200 | il spets) genom att rikta fluidflödet över PFU att dispergera parasiter i brunnen. Obs: Blanda väl accelererar parasiten lys av HFF monolager. Typ I RH stammar lysera den väl ~ 4 dagar efter blandning, kommer typ II Pru parasiter lysera väl ~ 5 dagar efter blandning. Välj ett dussin lyseras brunnar (kloner) och skrapa längst ned på varje av dessa lyserade brunnar med en 0,5-10 l pipett spets samtidigt drar upp 6 pl parasit lösning. Transfer den 6 pl av parasit lösning till en brunn i en 24-brunnar innehållande sammanflytande HFF-celler i 1 ml MPA + X selektionsmedium. Obs: Det är viktigt att skrapa på botten av brunnen för att hålla öppningen borrning av pipettspetsen i konstant kontakt med parasiter som bor i botten av brunnen. Övervaka 24-brunnar för lys av HFF-celler. Obs: Typ I RH parasiter typiskt lysera väl i 24-brunnar i ~ 4 dagar. Typ II Pru parasiter kommer typiskt lysera väl i ~ 5 dagar. Överför 2 pl av livskraftig parasit lösning skrapat från botten av varje brunn i 24-brunnars format till motsvarande brunn av en ny 24-brunnar innehållande konfluenta HFF-celler och 1 ml MPA + X selektionsmedium per brunn. Obs: Alla parasiter kloner och linjer kan vara kontinuerligt mainupprätthålls genom att passera 2 pl livskraftig parasit lösning var 7 dagar i 24-brunnar format. Kontrollera att parasiter framgångsrikt överförts till ett nytt 24-brunnar genom visuell inspektion med ljusmikroskop ~ 18 timmar efter passage. Harvest parasiter från de lyserade brunnar i 24-brunnar från steg 23 till 24 med hjälp av antingen en 1 ml eller 10 ml pipett och överför parasiten lösningen till ett Eppendorf-rör. Pellet parasiterna vid 1400 x g under 7 min, skölj en gång i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och pelleten igen vid 1400 x g under 3 min. Sug PBS från pelleten, tillsätt sedan 200 l PBS till pelleten att suspendera parasiter. Frys den parasit lösningen vid -80 ° C tills DNA-isolering. Isolera parasit-DNA från varje klon med användning av en vävnad Minikit DNA-isolering. Validera målsökta genen deletion (knockout) genom PCR med användning validering primrar (figurerna 2A-C). Test för denfrånvaro av den funktionella kodande regionen av genen av intresse och att använda den uppströms CXF och nedströms CXR genomiska primrar DNA (figurerna 2A-B)-test med avseende på närvaro av PCR-produkter som spänner över de genomiska riktade flanker och HXGPRT att demonstrera korrekt 5 'och 3 "målinriktad integrering av HXGPRT genen i den deleterade genlokuset. Obs: Primrar för validering måste vara unikt till genen av intresse eller ett falskt positivt resultat kan erhållas. Primer design kan valideras på http://www.toxodb.org genom sprängning primersekvenser till genomet (er) för att kontrollera primrar är unika. Passage parasit kloner på ett veckoschema som beskrivs i steg 24. När det riktade raderingen har validerats är fortsatt urval i MPA + X frivillig. Arkiv parasit kloner genom att förbereda frys bestånd. Pellets extracellulära parasiterfrån lyserade HFF-celler i en 25 cm 2 kulturen kolv, ta bort media och försiktigt återsuspendera parasit pelleten i cellkultur frysmediet vid en parasit koncentration> 4 x 10 7 parasiter per ml. Överför alikvoter till kryokärl och parasiter lagra på obestämd tid i flytande kväve eller vid -80 ° C. 2. Deletion av HXGPRT Detta protokoll är utformad för att ta bort HXGPRT markören från sin integration plats i genomet hos en genetiskt manipulerad Δ Ku80 stammen. Borttagning av HXGPRT möjliggör markör återvinning och alstring av stammar med flera genetiska manipulationer med enbart val baserade på HXGPRT 1-3. Medan protokollet beskrivs nedan beskriver metoden för att omorientera ett lokus för att radera HXGPRT, bör det noteras att avlägsnande av HXGPRT på gen-lokus av intresse också medger samtidig återintegrering av den vildtypgenen (complementation), återintegrering av en muterad gen, samt återintegrering av en taggad gen (N-eller C-terminala GFP, HA-tag, etc,), vilket möjliggör en mängd olika genetiska manipulationer. De verkningsmekanismer 24 och riktar protokoll med 6-tioxantin val har tidigare beskrivits 1-3,15. 2,1 Radera HXGPRT Excise HXGPRT selekterbara markören från pΔGOI genom digerering med RE.Z att skära på de unika restriktionsenzymställena flankerar HXGPRT (Figur 1B). Verifiera fullständig digerering av DNA med agarosgelelektrofores. Isolera den större av de två banden från agarosgelen. Obs: Den större av de två banden innehåller plasmiden tillsammans med 5 'och 3' DNA flankerna mål, men inte HXGPRT genen. Placera agaros avsnitt som innehåller större DNA-bandet i en spin kolumn laying gelén platt på membranet. Snurra kolonnen vid 13.000 x g under 4 min vid rumstemperatur. Tillsätt steril H2O till genomflödet för att bringa volymen till 100 | il. Obs: Andra kommersiella metoder finns tillgängliga för att isolera DNA från agaros. Koncentrera DNA genom EtOH utfällning, återsuspendering av DNA i en slutlig volym av 18 | il sterilt H2O Blanda 1 il av koncentrerade DNA med 7 ml H2O, 1 | il 10 x ligeringsbuffert och 1 | il T4-DNA-ligas (5 enheter) och placera reaktionen vid 4 ° C över natten för att generera pΔGOIc (pΔGOIclean) (figur 3A). Obs: DNA-fragment med RE.Z innehållande DNA ändar kan utformas och införas i detta steg för att skapa plasmider lämpade för målinriktat återintegrering av vildtypgenen (komplettering), riktad återintegrering av en muterad gen samt riktade återintegrering av ett taggat gen(N-eller C-terminal GFP, HA-markör, etc). Späd reaktionsblandningen 2x med sterilt H2O före elektroporering. Förvandla pΔGOIc till E. coli som i protokoll 1,1 att subklona, isolera, och validera den målsökande plasmiden. Sedan linearisera pΔGOIc inför transfektion (se steg 1.1.11 till 1.1.26). Upprepa parasiten transfektion protokoll som anges i protokoll nr 1.2 (steg 1 till 11). Obs: Innan genomföra steg 1 till 8, kontrollera att riktade borttagning av HXGPRT är genomförbart i den muterade stammen. Infektera en 150 cm 2 kolv av sammanflytande HFF-celler med 1 x 10 6 tachyzoiter av muterade stammen med 6-tioxantin (6TX) val av medium (200 ug / ml 6TX i infektion medium) och placera kolven i ett PFU-analysen. Inspektera kolven 8 dagar senare för att kontrollera att inga (eller mycket få, <10) PFU är synliga, vilket är viktigt att fastställa att potendande genmålsökning effektivitet kommer att överstiga eventuella spontan återgång av den muterade stammen till en fenotyp med reducerad HXGPRT uttryck (en 6TX fenotypen). Anmärkning: Ungefär 5 – 10% av HXGPRT integrationsställen uppvisar en signifikant och den spontana frekvensen av 6TX motstånd trots att HXGPRT markören fortfarande är integrerad vid målstället (se Representativa resultat avsnitt för förklaring). Börja 6TX urval ~ 20 h efter transfektion genom att ändra mediet i 150 cm 2 kolven till 6TX selektionsmedium. Obs: Stör inte kolven för ~ 10 dagar efter transfektion. Inspektera kolven för PFU bildning på dag 10 – 12 efter transfektion (typ I parasiter) eller dag kl 10 – 16 efter transfektion (typ II parasiter). Notera: Parasites blir måltavla för en strykning av HXGPRT kommer inte att börja växa under 6TX val tills HXGPRT genen och mRNA raderas och den resterande HXGPRT proteinet inaktiverats. Skaka urvalet kolven för att skapa en parasit lösning, och överföring 0,5-1,0 ml av parasiten lösningen till en ny 25 cm 2 kolv innehållande sammanflytande HFF-celler och 5 ml 6TX selektionsmedium. Upprepa överföringen från de primära 150 cm 2 till nya 25 cm 2 kolvar en gång per dag under två dagar. Obs: Flerfaldig provtagning ökar chanserna att fånga livsdugliga riktade parasiter som har förlorat HXGPRT genen. Inspektera 25 cm 2 kolvar ~ 5 dagar efter infektion för att kontrollera förekomsten av framkallning PFU med zoner av friska replikerande parasiter. Välj en eller två flaskor som innehåller zoner av infektion. Anmärkning: </strong> Parasiter raderas av HXGPRT genen replikera en normal tillväxttakt 6TX val. Fortsätt att passage parasiterna i 6TX selekteringsmedium. Subklonen parasiten befolkningen efter den 25 – 30 dagar av urval. Ställ in en 96-brunnar med ~ 1 parasit / brunn och en annan med ~ 2 parasiter / brunn. Förbered parasit DNA från isolerade kloner och upprätthålla kloner i en 24-brunnars format kultur enligt protokoll 1,2 (stegen 19-29). Validera radering av HXGPRT med PCR med den strategi som skisseras i figurerna 3A-B. Tre. C-terminal taggning av proteiner Detta protokoll är avsedd för C-terminal taggning av proteiner genom att rikta taggen för integration via dubbel kors över homolog rekombination vid genomiska Genen med MPA + X urval 2,4. Detta protokoll fungerar effektivt eftersom 5'-dhfr-sekvensen av <em> HXGPRT markör är en fullt validerad funktionell 3-otranslaterade regionen för andra gener 2,4. 3.1 Direkt C-terminal taggning av proteiner vid endogena genetiska loci Skapa targeting pΔGOItag plasmidkonstruktion med användning av jäst rekombinationskloning (Figur 4) och metoder som beskrivs i protokoll 1.1. Den 5 'genomiska inriktning flank innehåller de senaste 800 till 1.200 bp av kodande region (eller genomisk DNA) i de indiska myndigheterna, utom termineringskodonet flyttas till en position 3' till taggen val (HA-tag, Myc tag, His tag , etc.) Skapa den riktade insättningen av den C-terminala tagg på det endogena lokuset av proteinkodande genen genom att följa stegen i protokoll 1,1 och 1,2 med användning av strategi som beskrivs (figur 4). Verifiera insättningen av den C-terminala tagg på den endogena genen locus med hjälp av en PCR-strategi. Retarget genen locus använda metoder som beskrivs i protokoll 1, och protokoll 2 till delete den HXGPRT valbara markören för att skapa en exakt reglerad endogen genlocus som uttrycker ett taggat protein. Detta protokoll återvinner också HXGPRT selekterbar markör som kan användas igen för att rikta ett annat locus i den märkta stammen (se protokoll 1).