1.. Gene Targeting for at Slette et gen af interesse Denne protokol er udviklet til effektiv frembringelse af en mutantstamme, der har en målrettet gendeletion ved en defineret genetisk locus. Den tidligere beskrevne T. gondii hypoxantin-xanthin-guaninphosphoribosyltransferase (HXGPRT) markør anvendes i denne protokol til sikker og pålidelig markør indsættelse efter mycophenolsyre og xanthin (MPA + X) valg 14-16. Denne protokol anvender en valideret og omkostningseffektiv metode til at konstruere DNA målsøgningsmolekyler baseret på gær rekombinatorisk kloning 17,18. Flere alternative protokoller er kommercielt tilgængelige til konstruktion af rekombinante målsøgningsmolekyler ved hjælp bakterielle rekombinatoriske kloning metoder, in vitro rekombinatoriske kloning metoder eller fusion PCR. Protokollen beskrevet nedenfor giver den højeste samlede effektivitet og pålidelighed inddrive klonet præmisites besidder en målrettet gendeletion i Δ Ku80 stammer af T. gondii. 1.1 Forberedelse af målretning DNA Adgang ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) for at opnå genomiske sekvenser for genet af interesse (GOI). Bemærk: Genomiske sekvenser skal hentes fra type I, II eller III genom sekvens i ToxoDB database, der er tættest på stammen bliver manipuleret. For eksempel: GT1 for RH og ME49 for Pru. Design specifikke overlappende primere, der amplificerer 5'-og 3'-genomiske målretning flankerne af genet af interesse (GOI), der inkorporerer en 33 bp overlap med gær shuttle-vektoren pRS416 (eller alternativt pRS426) og indarbejde et 33 bp overlap med den selekterbare markør ( HXGPRT) (Figur 1A-B). Tilføj et unikt restriktionsenzymsted i hver primer i begge ender af 5'ennd 3 'genomiske målretning flanker, placeret mellem de 33 bp overlap og T. gondii-specifik primer-sekvens (er) (Figur 1A-B). Bemærk: En højere end 30 bp overlap er nødvendig for en effektiv gær rekombination kloning. 5'-og 3'-genomiske målretning flanker er designet til at forstærke specifikke DNA-fragmenter mellem 800 og 1.400 bp, der definerer en målrettet sletning. Vær opmærksom på, at kortere flanker markant vil reducere målrette effektivitet i Δ Ku80 Δ hxgprt baggrund 2. PCR amplificere 5'mål flanke anvendelse af primere F1 og R1, og PCR amplificere 3'mål flanke under anvendelse af primer F2 og R2 (Figur 1A-C) fra genomisk DNA 3.. Separat PCR amplificere ~ 2 Kbp HXPGRT gen der indbefatter de associerede 5'-og 3'-dhfr-flankerende regioner af HXGPRT cDNA pminiHXGPRT kassette 14 ved anvendelse af primerne HXF og HXR(Fig. 1B-C). Bemærk: Forstærk target flanker hjælp genomisk DNA fra forældrenes stamme til transficeres. Bemærk: Placer HXGPRT markør i fremad orientering i forhold til 5'-og 3'-DNA målretning flanker for at lette efterfølgende effektive genetiske manipulationer, såsom målrettede fjernelse af HXGPRT fra den afbrudte locus. Verificere korrekte PCR-produkt størrelser ved agarosegelelektroforese og estimere DNA-fragmentet koncentrationen hjælp agarosegel standarder eller en anden metode til bestemmelse af DNA-koncentrationen. Generere kompetente gær alikvoter som beskrevet i Gietz og Schiestly 17.. Kombiner 50 ng af 5 'genomisk målretning flanke, 50 ng 3' genomisk målretning flanke, 100 ng HXGPRT selektionsmarkør, og 50 ng lineariseret shuttle-vektor med sterilt H2O for at opnå et endeligt volumen på 10 -20 ul. Omdan kompetent gær med de tre PCR-produkter og gær-E. coli shuttle vektor for rekombinatorisk kloning ved hjælp af protokollen beskrevet af Gietz og Schiestly 17.. Plade transformeret gær på uracil-minus minimal-medium agarplader og inkuberes ved 30 ° C i 2 – 3 dage. Bemærk: Den ordnede samling af plasmidet, 5'mål flanke, den HXGPRT markering, og 3'mål flanke lettes af de konstruerede 33 bp overlap mellem de DNA-fragmenter (figur 1A-B), og medieres ved homolog rekombination i gær. Høst gær ved tilsætning af 2 ml 2x YPAD til uracil-minus plader og forsigtigt at skrabe at fjerne kolonier uden at forstyrre agaren. Centrifugeres gær opløsningen i 5 minutter ved 5.000 xg og supernatanten. Resuspender gær pellet i 250 ul af en resuspenderingsbufferen indeholdende RNaseA og tilføje 50-100 ul af encid-vaskede glasperler til løsningen. Vortex i 5 minutter ved den højeste hastighed for at knuse gærceller. Lad glaskugler for at sedimentere til bunden af røret og overføre supernatanten til et 2 ml Eppendorf-rør. Isoler gær-DNA ved hjælp af en miniprep DNA-isolering kit, resuspendering i et endeligt volumen på ~ 100 gl. Mix 2 pi gær DNA (~ 50 ng) med 40 ul DH10B elektroporation kompetent E. coli holdt på is. Opløsningen overføres til en kølet 2 mm spalte elektroporeringskuvette og elektroporere bakteriecellerne på 2,4 kV og 129 Ω. Rescue celler ved at tilsætte 0,8 ml SOC bouillon til hver kuvette og overføre opløsningen til en 14 ml snap-cap Falcon rør. Cellerne inkuberes ved 37 ° C i en tromle tromle til 40-60 min. Plate E. coli på 2xYT + ampicillin (AMP) plader og inkubere pladerne ved 37 ° C natten over. Vælg ~ 6 – 8 enkelte kolonier og vokse i 3 ml 2XYT + AMP for ~ 16 timer ved 37 ° C. <li> Forbered en 30% glycerol fryser bestand af hvert E. coli klon. Isoler plasmid pΔGOI fra E. coli kloner med en miniprep kit, resuspendering i et endeligt volumen på ~ 100 gl. Godkend pΔGOI hjælp restriktionsenzym fordøjer at måle DNA-plasmid størrelse og verificere den forventede pΔGOI DNA båndmønstre. Færdiggøre validering af pΔGOI ved DNA-sekventering af 5 'og 3' genomiske målretning flanker at kontrollere 100% DNA-sekvens baseret på genom sekvensdata i http://www.ToxoDB.org . Bemærk: Near perfect sekvenshomologi er afgørende for at maksimere gentargeting effektivitet 3 da hver basepar forskel udgør en tilsvarende nedskæring i længden af perfekt homologi. Bemærk: genom-sekvensen af type II Δku80 stamme baseret på Pru forældrenes stregn er ikke tilgængelig på dette tidspunkt. Dette arbejde bruger type II ME49 genomsekvens som surrogat genom for type II Δ Ku80 stamme. Baseret på sekvensdata på en række genetiske loci, anslås det, at den ME49 genom og Pru genomet udviser single nucleotide polymorphisms ved en frekvens på ~ 1 ud af 10.000 nukleotider eller mindre. Generer> 200 ug pΔGOI bestand ved at pode en ~ 250 ml 2XYT + AMP overnight kultur med glycerolstamopløsninger fra en valideret E. coli minipræp klon. Isoler pΔGOI plasmid-DNA fra den store kultur med en maxiprep DNA-isolering kit, resuspendering i et endeligt volumen på ~ 1.000 pi. Gentag restriktionsenzym fordøjer eller DNA-sekventering af pΔGOI maxiprep DNA'et at efterprøve den korrekte målretning DNA-molekyle før transfektion. Linearize ~ 15 ug pΔGOI ved 5 'enden med den unikke restriktionsenzym X (RE.X)fordøje sted indbygget i 5'mål flanke (figur 1B). Note: Gene målretning i T. gondii kræver et minimum af ~ 10 ug målrette DNA for at opnå en effektiv frekvens målretning begivenheder i gen locus af interesse 2. Validere linearisering af pΔGOI og bestemme DNA-koncentration ved agarosegelelektroforese eller en alternativ metode. Bemærk: Hvis restriktionsenzymfordøjelse ved 5'flanke ikke giver fuldstændig linearisering, den designede 3'kan unikt RE.Y fordøje stedet anvendes som et andet sted til linearisering af pΔGOI. Note: En helt lineariseret targeting DNA-molekylet er afgørende for en vellykket gen-targeting ved homolog rekombination i Δ Ku80 stammer. Neutraliseres restriktionsenzym ved incubating ved 68 ° C i 15 – 20 min. Forbered mindst 15 ug lineariseret plasmid i 100 ul sterilt H 2 O. Opbevares lineariseret pΔGOI ved -20 ° C indtil tidspunktet for transfektion. 1.2 Fremstilling af T. gondii parasitter, transfektion, udvælgelse, subkloning, validering, arkivering og vedligeholdelse af genetisk manipulerede stammer Generelle metoder til kultur og manipulation af T. gondii i humane forhudsfibroblast (HFF) celler er beskrevet 19-21. De Δ Ku80 Δ hxgprt stammer replikere normalt i parasitangrebet medium (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) vækstmedium suppleret med 1% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antimykotikum-antibiotisk fortyndet fra en 100x stamopløsning) 1,2. Alt arbejde med Toxoplasma gondii, skal udføres ved hjælp af biosikkerhed niveau 2 procedurer. T. gondii RHΔ Ku80 2 parental stamme blev genereret fra RHΔ hxgprt stammen fra Roos Lab 14.. Den PruΔku80 1 parentale stamme blev genereret fra PruΔhxgprt (Pru gniaud stamme BSG-4 22), som indeholder en stabilt integreret CAT selekterbar markør og et grønt fluorescerende protein (GFP) reporter under kontrol af den bradyzoite fase promotor LDH2. Pode en 25 cm 2-kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler med 1 x 10 6 levedygtig type I RH Δ Ku80 Δ hxgprt parasitter, eller pode to 25 cm2 kolber med 2 x 10 6 levedygtig type II Prugniaud (Pru) Δ Ku80 Δ hxgprt parasitter. Bemærk: Levedygtige parasitter er defineret som ekstracellulære parasitter, der har frisk lyseres ud. Note: </strong> Denne skala giver et tilstrækkeligt antal levedygtige parasitter i tre transfektionsforsøg. Efterse Δ Ku80 Δ hxgprt inficerede kulturer ~ 68-72 timer efter infektion. Kontrollér tilstedeværelse af levedygtige parasitter og ~ 90 – 95% lyse af HFF celler til at planlægge den præcise timing af transfektion. Bemærk: isolation af frisk egressed parasitter er afgørende for succes i denne protokol, fordi lav parasit levedygtighed vil afskaffe gen-targeting effektivitet. Agitere levedygtige parasitter i opløsning ved at lukke plug-segl låg på 25 cm 2-kolbe og rystes kraftigt kolben og tilbage at agitere parasitter ud af væksten overflade uden sprøjt væske på indersiden af låget eller halsen af kolben . Bemærk: Parasit høst kræver ikke en sprøjte-nål release protokol for type I-ellertype II Δ Ku80 stammer. Overfør parasitten løsning til en 10 ml sprøjte fastgjort til en filterholder indeholdende en 3 um membran og placere filterenheden på toppen af en åben 15 ml skruelåg rør. Sprøjte filtrere parasitter i 15 ml skruelåg rør. Bemærk: Filtrering af parasitter gennem membranen fjerner inficerede celler og cellulære debris. Bestem parasitten koncentration (tachyzoite former per ml) ved hjælp af et hæmocytometer. Note: Valgfrit: Brug parasitten løsning oprette en plaquedannende enhed (PFU) assay 21, der vil blive læst 7 – 8 dage senere for at bestemme den tilstrækkelige levedygtighed transfekterede parasitter (PFU at tachyzoite forholdet ≥ 0,2). Pellet parasitter til 7 min ved 1400 xg og aspirere supernatanten til ~ 0,4 ml uden at forstyrre parasitten pellet. Spin i 2 minutter ved 1,400 xg og aspirat resterende supernatant til ~ 0,01 ml uden at forstyrre parasitten pellet. Resuspender parasitten pellet ved flicking bunden af røret og straks tilføje cytomix 23 buffer (1.33x koncentration) for parasitten pellet for at opnå en parasit koncentration på 4 – 5 x 10 7 parasitter / ml cytomix. Bemærk: Udelad tilsætning af ATP og glutathion til cytomix da disse tilføjelser ikke forbedrer effektiviteten af genet målretning. Optø 100 ul alikvot af lineariserede pΔGOI fra protokol 1.1 (trin 26). Overfør 0,3 ml af parasitten cytomix opløsning (~ 1,3-1,6 x 10 7 parasitter) til 100 ul lineariseret pΔGOI fra protokol 1.1 (trin 26), og straks overføre hele 0,4 ml parasit + pΔGOI mix en kølet 2 mm spalte elektroporeringskuvette. Elektroporere parasitter ved 1,4 kV og 24 Ω. Rest transfektion kuvetten ved stuetemperatur i ~ 5 min derefter overføre hele indholdet af transfektion kuvetten i en 150 cm2 kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler med 30 ml infektion medium og inkubere den inficerede kultur natten over. Begynd udvælgelse i mycophenolsyre + xanthin (MPA + X) ~ 20 timer efter transfektion (fig. 2A) ved at erstatte infektion medium med MPA + X selektionsmedium (MPA (25 ug / ml) og xanthin (50 ug / ml) i infektion medium). Bemærk: Du må ikke forstyrre inkubationstiden MPA + X udvælgelse kolbe. Anslår det samlede antal PFU'er i MPA + X udvælgelse kolbe ~ 8 dage post-transfektion ved visuelt at inspicere monolag. Kontrollere tilstedeværelsen af udviklingen PFU og sunde zoner af infektion ved lysmikroskopi. Bemærk: Hvis plaques ikke er synlige ved dag 8, vedligeholde udvælgelse og monitor for tegn på smitteion da mutantstammer kan have en reduceret replikation sats. Bemærk: Δ Ku80 Δ hxgprt parasit stammer har en ekstremt lav baggrund af uønskede nontargeted begivenheder, som giver mulighed for en vellykket isolering af mutantstammer med ret alvorlige, men ikke dødelige vækstdefekter. Hvis et gen er afgørende, og det kan ikke slettes, den primære transfektion eller efterfølgende vedtaget parasit befolkning, kan afsløre en fænotype, hvor parasitterne ophøre at replikere under valget, da befolkningen beslutter at målrettede knockouts. Ryst kolben som i trin 3 for at fjerne ekstracellulære parasitter fra monolaget [efter synlige plaques har udviklet] for at generere en parasit løsning. Overførsel ~ 0,5 ml af parasitten løsning fra MPA + X udvælgelse kolbe til en 25 cm 2 MPA + X udvælgelse kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler (betegne denne kultur pass 1A). Fordrive parasits i de oprindelige 150 cm 2 MPA + X udvælgelse kolbe ~ 3 dage senere og overførsel ~ 0,5 ml parasit opløsning til en anden 25 cm2 MPA + X udvælgelse kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler (betegne denne kultur pass 1B). Tillad zoner af infektion at udvikle sig i hovedet 1A og / eller passere 1B flasker for ~ 5 dage. Visuelt kontrollere ved lysmikroskopi at pass 1A og 1B kolber indeholde minimum 25 levedygtige PFU'er med raske zoner af infektion. Vælg enten pass 1A eller pass 1B kolbe for fortsat passage i MPA + X udvælgelse medium i 25 cm2 kolber. Opretholde passage under MPA + X udvælgelse. Bemærk: Parasitter skal dyrkes i et tilstrækkeligt antal generationer at slette ikke-integreret vedvarende episomer fra befolkningen forud for subkloning. Udfør ikke subkloning før til 20 dage efter transfektion for type I RH Δ Ku80 Δ hxgprt eller før til 25 dage efter transfektion fortype II Pru Δ Ku80 Δ hxgprt parasitter at give tilstrækkelig tid til at fortynde ikke-integreret episomer 1,2. Subklon parasitter i en 96-brønds bakke indeholdende sammenflydende HFF celler med MPA + X selektionsmedium. Forbered en bakke i en koncentration på 1 parasit / brønd og en anden bakke i en koncentration på 2 parasitter / brønd. Bemærk: subklon parasitter, der for nylig lyserede (~ 90 – 95% af HFF celler i 25 cm2 kolbe) for at sikre, at parasitterne har høj levedygtighed. Bemærk: Den optimale tidsramme efter transfektion til subkloning blev etableret ved at måle, hvor hurtigt succes målrettede parasitter opstår ved en høj frekvens i den valgte population 1.. Fortsæt til passage den primære population af transficerede parasitter i MPA + X selektionsmedium ved hjælp af en ugentlig passage tidsplan for smitteen 25 cm 2 HFF kolbe med 10 pi af parasitten opløsningen. Bemærk: Hvis kloner bærer det målrettede genet (knockouts), ikke er opnået fra den første subkloning i trin 18, resubclone parasitterne fra løbende vedligeholdes befolkning ~ 10-12 uger efter transfektion. Note: En af grundene en gendeletion ikke opnås skyldes den episomale vedholdenhed nogle pΔGOI plasmider. Episomal vedholdenhed er bestemt af de sekvenser indeholdt i 5'-og 3'-genomiske målretning flanker og ikke synes at hidrøre fra HXGPRT genetiske element. Ca. 5 – 10% af målretning plasmider udviser signifikant episomal vedholdenhed, der nødvendiggør et senere tidspunkt af subkloning at tillade parasit befolkning et tilstrækkeligt antal generation gange at fortynde de vedvarende episomer og løse befolkningen primært stabile integranter. <ol start = "20"> Score 96-brønds bakke 6-7 dage efter subkloning (type I parasitter) eller 7 – 8 dage efter subkloning (type II parasitter) i brønde, der indeholder en enkelt PFU, identificeret som en enkelt zone af infektion i lysmikroskopi ved enten 40X eller 60X magt. Markere en lille prik på 96-brønds bakke låg til at udpege placeringen af PFU i brønden. Blande indholdet af hver brønd indeholdende en enkelt PFU anvendelse af en pipette på 50 pi (200 ul spids) ved at dirigere fluidumstrømmen over PFU at sprede parasitter i brønden. Bemærk: Blanding brønden accelererer parasit lyse af HFF monolag. Type I RH stammer vil lysere brønden ~ 4 dage efter blanding, vil type II Pru parasitter lyserer brønden ~ 5 dage efter blanding. Vælg et dusin lyseret brønde (kloner) og ridser på tværs i bunden af hver af disse lyserede brønde med en 0,5-10 pi pipettespids samtidig udarbejdelsen 6 pi parasit løsning. TransFer den 6 ul parasit løsning til en brønd i en 24-brønds bakke indeholdende sammenflydende HFF celler i 1 ml MPA + X selektionsmedium. Bemærk: Det er vigtigt at ridse bunden af brønden for at holde åbningen boring pipettespidsen i konstant kontakt med parasitter bosiddende i bunden af brønden. Overvåg 24-brønds bakke til lysis af HFF celler. Bemærk: Type I RH parasitter vil typisk lyserer brønden i 24-brønds format i ~ 4 dage. Type II Pru parasitter vil typisk lyserer brønden i ~ 5 dage. Overfør 2 pi levedygtig parasit opløsning ridset fra bunden af hver brønd i 24-brønds format til den tilsvarende brønd i en ny 24-brønds bakke indeholdende sammenflydende HFF celler og 1 ml MPA + X selektionsmedium per brønd. Bemærk: Alle parasitter kloner og linjer kan være kontinuerligt mainopretholdt ved at passere 2 pi levedygtig parasit løsning hver 7 dage i denne 24-brønds bakke format. Kontroller, at parasitter lykkedes overført til et nyt 24-brønds bakke ved visuelt at inspicere med lysmikroskopi ~ 18 timer efter passage. Harvest parasitter fra de lyserede brønde i 24-brønds bakke fra trin 23. – 24. hjælp af enten en 1 ml eller 10 ml pipette og overføres parasitten løsning til et Eppendorf-rør. Pelletere parasitter ved 1.400 x g i 7 minutter, en gang i 1 ml phosphat skylle saltvand (PBS), og pelleten igen ved 1.400 x g i 3 minutter. Aspirat PBS fra pillen, tilsæt derefter 200 pi PBS til pillen for at genfordele parasitter. Frys parasitten opløsning ved -80 ° C indtil DNA-isolering. Isoler parasit DNA fra hver klon med et væv DNA-isolering minisæt. Validere målgenet deletion (knockout) ved PCR under anvendelse validering primere (figur 2A-C). Test forfravær af funktionelle kodende region af genet af interesse og bruge opstrøms CXF og downstream thorax genomiske DNA-primere (figur 2A-B) test for tilstedeværelsen af PCR-produkter, der spænder de genomiske målretning flanker og HXGPRT demonstrerer korrekt 5'-og 3' "målrettet integration af HXGPRT gen i slettede gen locus. Bemærk: Primere til validering skal være unikke for genet af interesse eller et falsk positivt resultat kan opnås. Primer design kan valideres på http://www.toxodb.org ved sprængning primersekvenser til genomet (r) for at kontrollere primere er unikke. Passage parasit kloner på en ugeplan, som beskrevet i trin 24.. Når til målrettet sletning er blevet valideret, fortsatte udvælgelse i MPA + X er valgfrit. Arkiv parasit-kloner ved at forberede fryser bestande. Pellet ekstracellulære parasitterfra lyserede HFF celler i en 25 cm2 dyrkningskolbe, fjerne medier og forsigtigt resuspender parasit pellet i cellekultur frysemedium på en parasit koncentration> 4 x 10 7 parasitter per ml. Overførsel alikvoter til kryoglas og gemme parasitter på ubestemt tid i flydende nitrogen eller ved -80 ° C. 2.. Sletning af HXGPRT Denne protokol er beregnet til at fjerne HXGPRT markør fra dets integration site i genomet af en genetisk manipuleret Δ Ku80 stamme. Fjernelse af HXGPRT tillader markør genopretning og generering af stammer med flere genetiske manipulationer kun bruger markeringer baseret på HXGPRT 1-3. Medens protokollen beskrevet nedenfor beskriver fremgangsmåden til at re-målrette en locus at slette HXGPRT, skal det bemærkes, at fjernelsen af HXGPRT på gen-locus af interesse også tillader samtidig reintegration af vildtype-genet (complementation), re-integration af et mutantgen, samt re-integration af et kodet gen (N-eller C-terminale GFP, HA-mærke, osv.), der giver mulighed for en række genetiske manipulationer. De virkningsmekanismer 24 og målretning protokoller anvender 6-thioxanthin markeringer er tidligere blevet beskrevet 1-3,15. 2.1 Slet HXGPRT Udskaer HXGPRT selekterbare markør fra pΔGOI ved fordøjelse med RE.Z at skære på de unikke restriktionsenzymsteder flankerer HXGPRT (figur 1B). Verificere fuldstændig fordøjelse af DNA ved agarosegelelektroforese. Isolere det største af de to bånd fra agarosegelen. Bemærk: Den største af de to bånd indeholder plasmidet sammen med de 5 'og 3' DNA target flanker, men ikke den HXGPRT genet. Placer agarose, som indeholder større DNA-bånd i en centrifugesøjle laying gel fladt på membranen. Spin søjlen ved 13.000 x g i 4 minutter ved stuetemperatur. Tilføj sterilt H 2 O til gennemstrømning for at bringe volumen til 100 gl. Note: Andre kommercielle metoder til at isolere DNA fra agarose. Koncentrer DNA ved EtOH udfældning, resuspendering af DNA i et slutvolumen på 18 pi sterilt H 2 O. Bland 1 pi koncentreret DNA med 7 ml H2O, 1 pi 10x ligeringspuffer og 1 pi T4 DNA ligase (5 enheder) og placere reaktionen ved 4 ° C natten over for at generere pΔGOIc (pΔGOIclean) (figur 3A). Bemærk: DNA-fragmenter med RE.Z indeholder dna ender kan udformes og medtages på dette trin til at oprette plasmider er egnede til målrettet re-integration af vildtypegenet (komplementering), målrettede re-integration af et mutant gen samt målrettet reintegration af et kodet gen(N-eller C-terminale GFP, HA-mærke osv.). Reaktionsblandingen fortyndes 2x med sterilt H2O før elektroporering. Omdan pΔGOIc ind i E. coli som i protokol 1.1 til subklone, isolere, og validere målretningen plasmid. Så linearize pΔGOIc som forberedelse til transfektion (se trin 1.1.11 til 1.1.26). Gentag parasitten transfektionsprotokol som skitseret i protokol 1.2 (trin 1 til 11). Bemærk: Forud for gennemførelsen trin 1 til 8, kontrollere, at målrettet fjernelse af HXGPRT er muligt i mutant stamme. Inficere en 150 cm 2 flaske sammenflydende HFF celler med 1 x 10 6 tachyzoitter af mutant stamme hjælp 6-thioxanthin (6TX) udvælgelse medium (200 pg / ml 6TX i infektion medium), og kolben anbringes i en PFU assay. Undersøg kolben otte dage senere for at kontrollere at ingen (eller meget få, <10) PFU er synlige, hvilket er afgørende for at fastslå, at potentiale genmålretning effektivitet vil overstige enhver potentiel spontan reversion af mutant stamme til en fænotype med nedsat HXGPRT udtryk (a 6TX resistensfænotype). Bemærk: Ca. 5 – 10% af HXGPRT integration sites udviser en betydelig og hyppighed af spontane 6TX modstand selvom HXGPRT markør stadig integreret på målrettet websted (se Repræsentative resultater sektion for forklaring). Begynd 6TX udvælgelse ~ 20 timer efter transfektion ved at ændre mediet i 150 cm2 kolbe til 6TX selektionsmedium. Bemærk: Du må ikke forstyrre kolben for ~ 10 dage efter transfektion. Undersøg kolben for PFU dannelse på dag 10-12 post-transfektion (type I parasitter) eller dag 10-16 post-transfektion (type II parasitter). Note: Parasites at blive målrettet til sletning af HXGPRT vil ikke begynde at vokse under 6TX valg indtil HXGPRT genet og mRNA bliver slettet, og den resterende HXGPRT protein er inaktiveret. Ryst udvælgelsen kolben for at skabe en parasit løsning, og overførsel 0,5-1,0 ml af parasitten løsning på en ny 25 cm 2-kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler og 5 ml 6TX selektionsmedium. Gentag overførslen fra den primære 150 cm 2 til nye 25 cm2 kolber gang dagligt i to dage mere. Bemærk: Multiple sampling øger chancerne for at fange levedygtige målrettede parasitter, der har mistet HXGPRT genet. Efterse 25 cm 2 kolber ~ 5 dage efter smitte at kontrollere tilstedeværelsen af at udvikle PFU'er med zoner af sunde replikerende parasitter. Pick en eller to kolber indeholdende zoner af infektion. Note: </sTrong> Parasitter slettet af HXGPRT genet replikere en normal vækst i 6TX valg. Fortsæt med at passage parasitterne i 6TX valg medium. Subklone parasitten befolkning efter 25 – 30 dage af markering. Opsæt en 96-brønds bakke med ~ 1 parasit / godt og et andet med ~ 2 parasitter / brønd. Forbered parasit DNA fra isolerede kloner og fastholde kloner i en 24-brønds format kultur ifølge protokol 1.2 (trin 19-29). Godkend sletning af HXGPRT ved PCR ved den strategi, der er skitseret i figur 3A-B. 3.. C-terminale tagging af proteiner Denne protokol er udviklet til C-terminal mærkning af proteiner ved at målrette tag for integrationen via dobbelt cross over homolog rekombination på det genomiske locus af genet ved hjælp af MPA + X udvælgelse 2,4. Denne protokol fungerer effektivt, fordi 5'dhfr sekvens af <em> HXGPRT markør er en fuldt valideret funktionelt 3'-utranslaterede område for andre gener 2,4. 3.1 Direkte C-terminale mærkning af proteiner endogene genetiske loci Skabe målretning pΔGOItag plasmidkonstruktion bruge gær rekombinatorisk kloning (figur 4) og metoder beskrevet i protokol 1.1. 5'genomiske målretning flanke indeholder de sidste 800 til 1.200 bp af kodningsområdet (eller genomisk DNA) fra den indiske regering, undtagen termineringskodonen er flyttet til en stilling 3 'i forhold til tag valg (HA-mærke, Myc-tag, His-tag , osv.) Opret målrettet indsættelse af C-terminale tag på det endogene locus proteinkodende gen ved at følge trinene i protokol 1.1 og 1.2 ved hjælp af strategien skitseret (figur 4). Kontroller indsættelsen af den C-terminale tag på det endogene gen locus ved hjælp af en PCR-strategi. Retarget genet locus anvendelse af metoder beskrevet i protokol 1, og protokol nr. 2 til delete den HXGPRT selekterbare markør for at skabe en præcist reguleret endogene gen locus, der udtrykker et kodet protein. Denne protokol også genopretter den HXGPRT selekterbare markør, der kan bruges igen til at målrette et andet locus i den mærkede stamme (se protokol 1).