Brug af Image Cytometry til kvantificering af patogene svampe i forbindelse med Host Cells
Summary
Her viser vi, hvordan billedet cytometri kan anvendes til kvantificering af patogene svampe i forbindelse med værtsceller i kultur. Denne teknik kan anvendes som et alternativ til CFU tælling.
Abstract
Undersøgelser af de cellulære patogenese mekanismer patogene gær såsom Candida albicans, Histoplasma capsulatum, og Cryptococcus neoformans almindeligvis anvender infektion af mammale værter eller værtsceller (dvs. makrofager) efterfulgt af gær kvantificering hjælp kolonidannende enhed analyse eller flowcytometri. Mens kolonidannende enhed tælling har været den mest anvendte metode i marken, denne teknik har ulemper og begrænsninger, herunder langsom vækst i nogle svampearter på faste medier og lave og / eller variabel plating effektivitet, som er af særlig bekymring, når man sammenligner vækst af vildtype og mutant stammer. Flowcytometri kan levere hurtige kvantitative oplysninger om gær levedygtighed, har dog vedtagelse af flowcytometrisk detektion for patogene gær været begrænset til en række praktiske årsager, herunder høje omkostninger og biosikkerhed overvejelser. Her viser vi et billede-baseretcytometrisk metode bruger Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) til kvantificering af levedygtige patogene gær i co-kultur med makrofager. Vore undersøgelser fokuserer på påvisning af to humane patogene svampe: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum koloniserer alveolære makrofager ved at replikere i makrofager fagosomet, og her, vi kvantitativt vurdere væksten af H. capsulatum gær i RAW 264,7 makrofager ved hjælp acridinorange / propidiumiodid-farvning i kombination med billedet cytometri. Vores metode trofast redegør væksttendenser som målt ved traditionel kolonidannende enhed tælling, men med væsentligt forøget følsomhed. Desuden har vi direkte vurdere infektion af levende makrofager med et GFP-udtrykkende stamme af C. albicans. Vores metode tilbyder en hurtig, præcis og økonomisk midler til detektion og kvantificering af vigtige menneskelige svampepatogener i samarbejde with værtsceller.
Introduction
Undersøgelser af patogene svampe i samarbejde med deres værter og / eller værtsceller kræver ofte kvantificering af levedygtige svampeceller over en kursus eller under forskellige infektion forhold. Tælling af kolonidannende enheder (CFU) er den standard metode, hvorved antallet af levedygtige svampeceller er blevet målt, men denne teknik har flere ulemper og begrænsninger. Først, mange svampearter vokser langsomt. Vækst af synlige kolonier på faste medier kan tage 1-2 uger, hvilket er betydeligt langsommere tempo for forskningen. For det andet, manipulation af prøver i løbet af CFU plating er en møjsommelig proces, da flere fortyndinger skal belagt for at sikre et tælleligt antal kolonier. Det tredje er antallet af CFU er typisk lavere end antallet af levedygtige belagt organismer fordi udpladningseffektiviteten er godt under 100%. For eksempel kan plating effektivitet for den dimorfe svampepatogenet Histoplasma capsulatum være så høj som 90%, men er rutinemæssigt så lav som30%, og er endnu lavere (10%) for den relaterede svampe dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Udpladningseffektivitet for Candida albicans er også genstand for variation 3.. Endelig CFU analyse tegner sig kun for levende og aktivt delende celler kan godtgøre vækst på faste medier, mens der i mange situationer vil det være nyttigt at bestemme tilstedeværelsen og koncentrationen af døde og / eller metabolisk inaktive celler.
Tidligere har flowcytometriske metoder til kvantificering af adskillige patogene svampearter blevet beskrevet 4-6. Men på grund biosikkerhed indeslutning problemer forbundet med at bruge biosikkerhed niveau 2 (BSL2) eller BSL3 niveau patogener på fælles flowcytometre, har vedtagelsen af denne teknik været begrænset. Ligesom flowcytometri, er billedet cytometri en følsom og hurtig metode til celle kvantificering. Dog kan billede cytometri udføres på en brøkdel af omkostningerne med sammenlignelige resultater 7 –11.. Her beskriver vi fremgangsmåder til udførelse billede cytometri af patogene svampe i forbindelse med værtsceller. Vi viser vores metoder ved hjælp af to humane patogene svampe: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum er en dimorf svampepatogen der forårsager respiratorisk sygdom, hos mennesker, vokser det som spirende gær og gentagelser inden alveolære makrofager Candida albicans er et menneske kommensale arter, der lejlighedsvis forårsager candidiasis.. Vi viser, at billedet cytometri tillader hurtig kvantificering af disse gærtyper, sammen med visualisering kapacitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Billede cytometri tillader brugeren at fange billeder i høj kvalitet og ved hjælp af specialiseret software, udføre en hurtig kvantificering af celler. Én potentiel udfordring til vedtagelsen af billedet cytometri inden for mikrobiel patogenese er, at mikrober, der skal tælles, er til stede i en blandet population af celler, herunder pattedyrværtsceller. Her viser vi, at billedet cytometri kan anvendes til kvantificering af levedygtige patogene gær under in vitro makrofag infektion. Vores metodolog…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
Referências
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
