Utilisation de la cytométrie d'image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes
Summary
Ici, nous démontrons comment cytométrie d'image peut être utilisé pour la quantification des champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes en culture. Cette technique peut être utilisée comme une alternative à la CFU énumération.
Abstract
Les études sur les mécanismes de la pathogenèse cellulaire de levures pathogènes telles que Candida albicans, Histoplasma capsulatum et Cryptococcus neoformans communément emploient infection des hôtes mammifères ou des cellules hôtes (c.-à macrophages), suivie par la quantification de la levure en utilisant formant colonie analyse de l'unité ou la cytométrie de flux. Bien unité formant colonie énumération a été la méthode la plus couramment utilisée dans le domaine, cette technique présente des inconvénients et limitations, y compris la croissance lente de certaines espèces fongiques sur des supports solides et des rendements faibles et / ou variable placage, ce qui est particulièrement préoccupant lorsque l'on compare la croissance des souches de type sauvage et mutant. La cytométrie en flux peut fournir des informations quantitatives rapide en ce qui concerne la viabilité des levures, cependant, l'adoption de détection par cytométrie en flux pour les levures pathogènes a été limité à un certain nombre de raisons pratiques, y compris son coût élevé et considérations de biosécurité. Ici, nous démontrons une image-méthodologie cytométrie utilisant la Vision Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) pour la quantification des levures pathogènes viables en co-culture avec des macrophages. Nos études portent sur la détection de deux pathogènes fongiques humains: Histoplasma capsulatum et Candida albicans H.. capsulatum colonise les macrophages alvéolaires en reproduisant dans le phagosome des macrophages, et ici, nous évaluer quantitativement la croissance de H. levures capsulatum dans des macrophages RAW 264.7 en utilisant l'acridine orange / iodure de propidium coloration en combinaison avec cytométrie d'image. Notre méthode fidèlement récapitule les tendances de croissance tels que mesurés par colonie traditionnelle formant unité énumération, mais avec une sensibilité accrue de manière significative. En outre, nous évaluons directement infection des macrophages vivants avec une souche exprimant la GFP de C. albicans. Notre méthodologie offre un moyen rapide, précis et économique pour la détection et la quantification d'agents pathogènes fongiques humains importants en association esprith cellules hôtes.
Introduction
Études de champignons pathogènes, en association avec leurs hôtes et / ou des cellules hôtes ont souvent besoin de quantification des cellules fongiques viables sur un parcours de temps ou dans des conditions différentes de l'infection. Dénombrement des unités formant colonie (UFC) est la méthode standard par lequel le nombre de cellules fongiques viables a été mesurée, cependant, cette technique présente plusieurs inconvénients et limitations. Premièrement, de nombreuses espèces de champignons ont une croissance lente. La croissance des colonies visibles sur des supports solides peut prendre 1-2 semaines, ce qui ralentit considérablement le rythme de la recherche. Deuxièmement, la manipulation des échantillons durant UFC placage est un processus laborieux, depuis plusieurs dilutions doivent être étalées pour assurer un nombre dénombrable de colonies. Troisièmement, le nombre d'UFC est généralement plus faible que le nombre d'organismes viables plaqué parce que l'efficacité de placage est bien en dessous de 100%. Par exemple, l'efficacité de placage pour le champignon Histoplasma capsulatum pathogène dimorphisme peut être aussi élevée que 90%, mais sont systématiquement aussi bas que30% et sont encore plus faibles (10%) pour le fongique liée dimorphe Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. l'efficacité de placage pour Candida albicans est également soumis à la variabilité 3. Enfin, l'analyse UFC représente uniquement les cellules vivantes et en divisant activement capables de créer de la croissance sur milieu solide, alors que dans de nombreuses situations, il serait utile de déterminer la présence et la concentration de cellules inactives morts et / ou métabolique.
Auparavant, les méthodes de cytométrie en flux pour la quantification de plusieurs espèces de champignons pathogènes a été décrite 4-6. Toutefois, en raison de problèmes de confinement de biosécurité liés à l'utilisation du niveau de biosécurité 2 (BSL2) ou pathogènes BSL3 niveau sur cytomètres partagés, l'adoption de cette technique a été limitée. Comme la cytométrie en flux, la cytométrie l'image est une méthode rapide et sensible de la quantification des cellules. Cependant, cytométrie d'image peut être effectuée à une fraction du coût avec des résultats comparables 7 –11. Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer cytométrie en image de champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes. Nous démontrons nos méthodes utilisant deux champignons pathogènes humains: Histoplasma capsulatum et Candida albicans H.. capsulatum est un champignon pathogène dimorphisme qui provoque des maladies respiratoires, chez les humains, il pousse la levure comme herbe et se multiplie dans les macrophages alvéolaires Candida albicans est une espèce commensale de l'homme qui cause parfois candidose.. Nous montrons que cytométrie d'image permet une quantification rapide de ces levures, ainsi que la capacité de visualisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
cytométrie en image permet à l'utilisateur de capturer des images de haute qualité et, à l'aide de logiciels spécialisés, effectuer une quantification rapide des cellules. Un défi potentiel à l'adoption de cytométrie d'image dans le domaine de la pathogenèse microbienne est que les microbes soient comptabilisées sont présents dans une population mixte de cellules, dont les cellules hôtes de mammifères. Ici, nous démontrons que cytométrie d'image peut être utilisé pour la quantificat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
Referências
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
