Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen
Summary
Hier zeigen wir, wie Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen in der Kultur verwendet werden. Diese Technik kann als Alternative zu CFU Aufzählung verwendet werden.
Abstract
Untersuchungen der zellulären Pathogenese pathogener Hefen wie Candida albicans, Histoplasma capsulatum und Cryptococcus neoformans verwenden üblicherweise Infektion von Säugetier-Hosts oder Wirtszellen (zB Makrophagen) durch Hefe Quantifizierung mittels koloniebildende Einheit Analyse oder Durchflusszytometrie gefolgt. Während koloniebildende Einheit Aufzählung ist das am häufigsten verwendete Verfahren auf dem Gebiet hat diese Technik Nachteile und Beschränkungen, einschließlich der langsamen Wachstum einiger Pilzarten auf festen Medien und nieder-und / oder variable Beschichtung Wirkungsgrade, die von besonderer Bedeutung ist bei einem Vergleich Wachstum von Wildtyp-und Mutanten. Durchflusszytometrie können schnelle quantitative Informationen über Hefelebensfähigkeit bieten hat jedoch Verabschiedung durchflusszytometrischen Nachweis für pathogene Hefen für eine Reihe von praktischen Gründen, einschließlich seiner hohen Kosten und die biologische Sicherheit Überlegungen beschränkt. Hier zeigen wir eine bildbasiertecytometric Methodik mit der Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) für die Quantifizierung von lebensfähigen pathogenen Hefen in Co-Kultur mit Makrophagen. Histoplasma capsulatum und Candida albicans H.:. Unsere Studien auf dem Nachweis von zwei menschlichen Pilzpathogene konzentrieren capsulatum kolonisiert Alveolarmakrophagen durch die Replikation innerhalb der Makrophagen phagosome, und hier haben wir quantitativ das Wachstum von H. capsulatum Hefen in RAW 264.7 Makrophagen mit Acridinorange / Propidiumiodidfärbung in Kombination mit Bildzytometrie. Unsere Methode treu rekapituliert Wachstumstrends wie durch traditionelle Kolonie bildende Einheit Aufzählung gemessen, aber mit deutlich erhöhter Empfindlichkeit. Zusätzlich haben wir direkt beurteilen Infektion von lebenden Makrophagen mit einem GFP-exprimierenden Stamm von C. albicans. Unsere Methodik bietet eine schnelle, genaue und kostengünstige Mittel zur Detektion und Quantifizierung von wichtigen menschlichen pilzliche Erreger in Verbindung with Wirtszellen.
Introduction
Studien von pathogenen Pilzen in Verbindung mit ihren Gastgebern und / oder Wirtszellen erfordern oft Quantifizierung der lebensfähigen Pilzzellen über einen Zeitverlauf oder unter verschiedenen Bedingungen Infektion. Zählung der koloniebildenden Einheiten (CFU) der Standard-Methode, durch die die Zahl der lebensfähigen Pilzzellen gemessen wurde, jedoch hat dieses Verfahren einige Nachteile und Einschränkungen. Erstens sind viele Pilzarten langsam wachsende. Das Wachstum der sichtbaren Kolonien auf festen Medien kann 1-2 Wochen, deutlich verlangsamt das Tempo der Forschung. Zweitens ist Manipulation von Proben während der CFU Beschichtung ein langwieriger Prozess, da mehrere Verdünnungen müssen beschichtet, um eine zählbare Anzahl der Kolonien zu gewährleisten. Drittens, ist die Anzahl der CFU typischerweise geringer als die Zahl von lebensfähigen Organismen, weil die Beschichtung überzogen Wirkungsgrad deutlich unter 100%. Zum Beispiel kann Plattieren Wirkungsgrade für die dimorphic Pilzpathogen Histoplasma capsulatum so hoch wie 90%, aber routinemäßig so niedrig wie30% und sogar noch niedriger (10%) für die entsprechende Pilz dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Plating Effizienz für Candida albicans ist auch Gegenstand Variabilität 3. Schließlich entfallen CFU Analyse für nur leben und sich aktiv teilenden Zellen, die zur Festlegung Wachstum auf festen Medien, wobei in vielen Situationen, wäre es nützlich, um die Anwesenheit und Konzentration von toten und / oder metabolisch inaktiven Zellen zu bestimmen.
Zuvor hat durchflusszytometrischen Methoden zur Quantifizierung von mehreren pathogenen Pilzarten wurden 4-6 beschrieben. Doch aufgrund Biosicherheit Containment Probleme bei der Verwendung Sicherheitsstufe 2 (BSL2) oder BSL3-Level Krankheitserreger auf gemeinsamen Durchflusszytometern beteiligt hat Annahme dieser Technik beschränkt. Wie Durchflusszytometrie ist Bildzytometrie eine sensible und schnelle Methode der Zelle Quantifizierung. Allerdings kann Bildzytometrie zu einem Bruchteil der Kosten mit vergleichbaren Ergebnissen 7 durchgeführt werden –11. Hier beschreiben wir Verfahren zur Durchführung Bildzytometrie von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen. Wir demonstrieren unsere Methoden mit zwei menschlichen Pilzpathogene: Histoplasma capsulatum und Candida albicans H.. capsulatum ist ein dimorphic Pilzpathogen, die Erkrankung der Atemwege verursacht, in den Menschen, es wächst wie Bäckerhefe und repliziert in Alveolarmakrophagen Candida albicans ist ein Mensch kommensalen Arten, die gelegentlich verursacht Candidiasis.. Wir zeigen, dass Bildzytometrie schnelle Quantifizierung dieser Hefen ermöglicht, zusammen mit Visualisierungsmöglichkeiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bildzytometrie ermöglicht es dem Benutzer, um qualitativ hochwertige Bilder zu erfassen und mit spezieller Software, führen Sie eine schnelle Quantifizierung von Zellen. Eine mögliche Herausforderung für die Annahme Bildzytometrie im Bereich der mikrobiellen Pathogenese ist, dass die Mikroorganismen zu zählen, die in einer gemischten Population von Zellen, einschließlich Säuger-Wirtszellen sind. Hier zeigen wir, dass Bildzytometrie zur Quantifizierung von lebensfähigen pathogenen Hefen während der in vitro-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
Referências
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
