実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析
Summary
脳の炎症反応の複雑さに新たな洞察を得るための方法が提示される。我々は、局所虚血のマウスモデルにおけるミクログリア/マクロファージの表現型マーカーの共発現パターンを調べるために、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを記載している。
Abstract
脳卒中のミクログリア/マクロファージの後に（M / M）は、新規表面抗原の発現および構築し、炎症反応を維持するメディエーターの産生を含む劇的な形態学的および表現型変化と急速な活性化を受ける。新たな証拠は、M / Mは、急性脳損傷後の古典（M1）の炎症誘発性または代替抗炎症（M2）の活性化を引き受けることができる、高度なプラスチック細胞であることを示しています。しかし負傷した脳内のM / Mの表現型マーカー発現、彼らの共局在的、時間的進化の完全な特徴付けは、依然として行方不明です。
具体的にはM / M活性化の関連するマーカーを免疫蛍光染色プロトコルは、虚血性脳内で行うことができる。ここでは、局在化およびのようなM / M表現型マーカーの共発現パターンを調査するための強力なアプローチとして、三次元共焦点免疫蛍光分析を行っベースのプロトコルを提示のCD11b、CD68、Ym1は、中大脳動脈（pMCAOの）の永久閉塞によって誘発される局所的虚血のマウスモデルにおいて。染色された領域の二次元解析では、各マーカーが定義され、M / Mの形態に関連しており、虚血性病変内の指定されたローカライズを持っていることが明らかになった。 M / M表現型マーカーの共発現のパターンは、虚血領域における三次元共焦点イメージングによって評価することができる。画像は、ブリードスルーの影響を最小限にし、波長の重なりを回避する順次走査モードで（180 X 135×10ミクロンの体積に相当する、10〜z軸と0.23μmのステップサイズ）規定された体積にわたって取得することができる。画像は、IMARISソフトウェアを用いて三次元レンダリングを得るために処理される。 3次元レンダリングの固体ビューは細胞のクラスターにおけるマーカー発現の定義を可能にする。我々は、M / M、病変部位およびtiの場所に応じて、多数の表現型に分化する能力を有することを示す私損傷後。
Introduction
急性脳損傷の後、ミクログリアは急速に活性化し、劇的な形態学的および表現型を受けている1〜3に変更されます。この組み込み関数応答が負傷脳実質4,5内に移動血液由来のマクロファージの動員に関連している。脳損傷における抗原的に区別できない小膠細胞およびマクロファージの役割（以下、M / Mという）まだ議論されている。研究が増えても同様に、末梢マクロファージについて記載されたものに、ミクログリアおよび脳はマクロファージが、その極端な（M1）の古典的な前炎症性毒性または抗炎症保護（M2）の表現型に対応して異なる表現型をとることができる募集、ことを示している。炎症または抗炎症因子の分泌を含む異なる活性化状態、神経栄養性分子およびリソソーム活性の放出は、その発現が時間的に依存する表現型マーカーの特定のパターンによって特徴付けられる周囲の環境の進化。負傷した脳内のこれらのM / Mの表現型の特徴付けはまだ乏しいです。私たちは、脳卒中後のM / Mの発現と進化を分析するpMCAOのの老舗マウスモデルを使用していました。ここで紹介する免疫蛍光ベースのプロトコルは、特定のM / M表現型マーカー、それらの局在と虚血領域における細胞の共発現の外観への洞察を得ることを目指しています。我々は、異なる活性化状態または表現型に関連するいくつかの分子を調べ、すなわちのCD11b、白血球及びM / Mの活性化/人材紹介6-8の広く使われているマーカーによって発現される表面マーカー、CD68リソソーム6,7とYm1は分泌のマーカータンパク質は、代替的にアクティブ化（M2）、マクロファージで発現し、回復と機能回復9月10日に関連付けられている。
2マーカーが同じセルによってではなく、様々な細胞内コンパートメントで表現されている場合、単独の共局在はあまりINFできない場合がありますormative。この場合、共発現の分析は、単一の平面図を用いて三次元レンダリングを行うことができる。ここでは、マーカーの同時発現の完全な三次元解析を得るためのプロトコルを記載している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは虚血領域への局在化およびM / M表現型マーカーの共発現を調査するための強力なアプローチ（より詳細な分析のために、参考文献6を参照）のような三次元共焦点解析に続いて免疫蛍光ベースのプロトコルを提示する。この方法は、3次元共焦点イメージングとM / Mの活性化の関連マーカーの特異的染色を兼ね備えています。抗体、血清および作業希釈液をfluorconjugatedの微調整?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ステファノフマガッリはMonzino財団の仲間です。
Materials
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| Hoechst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. |
Referências
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
- Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
- Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373 (2007).
- Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943 (2011).
- Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
- Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).
