실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석
Summary
뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.
Abstract
뇌 스트로크 미세 아교 세포 / 대 식세포 후 (M / M)가 새로운 표면 항원의 발현 및 축적되어 염증 반응을 유지하는 매개체의 생산을 포함 극적인 형태 및 표현형의 변화와 급속한 활성화를 받고있다. 신흥 증거는 M / M은 급성 뇌 손상 후 클래식 (M1) 염증성 또는 다른 항 염증 (M2) 활성화를 가정 할 수있다 높은 플라스틱 셀 있음을 나타냅니다. 그러나 부상 뇌의 M / M 표현형 마커 표현, 자신의 colocalization을 시간적 진화의 전체 특성은 아직 행방 불명입니다.
구체적으로는 M / M 활성화의 관련 마커를 염색 면역 프로토콜은 허혈성 뇌에서 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 현지화와 같은 M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 촛점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시CD11b를, CD68, YM1, 중대 뇌동맥 (pMCAO)의 영구적 인 폐쇄에 의해 유도 된 국소 허혈의 마우스 모델에서. 오염 된 곳의 두 가지 차원의 분석은 각각의 마커가 정의 된 M / M의 형태에 관련된 및 허혈성 병변에 지정된 현지화를 가지고 있는지 알 수있다. M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴은 허혈 영역에서 입체 공 촛점 이미징에 의해 평가 될 수있다. 이미지가 비쳐 영향을 최소화하고, 파장 중복을 피하기 위해 순차 주사 모드 (180 X 135 X 10 ㎛의 부피에 해당하는 10 ㎛ Z 축 및 0.23 μm의 스텝 사이즈) 정의 된 볼륨에서 취득 할 수있다. 이미지이어서 Imaris 소프트웨어에 의해 입체 렌더링을 얻기 위해 처리된다. 세 가지 차원 렌더링의 단단한보기는 세포의 클러스터에있는 마커 식의 정의를 할 수 있습니다. 우리는 M / M은 병변 사이트 및 TI의 위치에 따라, 표현형의 다수쪽으로 분화하는 능력을 가지고 있음을 보여나 부상 후.
Introduction
급성 뇌 손상 후, 미세 아교 세포가 빠르게 활성화 극적인 형태 적 형질 1-3을 변경 받아야합니다. 이 내장 함수는 응답은 부상 뇌 실질 4.5으로 마이그레이션 혈액 태생의 대 식세포의 모집에 연결되어 있습니다. 항원 적으로 구별되지 않는 미세 아교 세포 및 대식 세포의 역할은 뇌 손상에서 여전히 논의된다 (이제부터 M / M라고한다). 연구의 증가는 유사 주변 식세포에 대해 설명한 것과, 미세 아교 세포와 뇌가 대식 세포는 그 극단 (M1) 고전적인 염증성 독성이나 항 염증 보호 (M2) 표현형에 해당하는 서로 다른 표현형을 가정 할 수 모집을 나타냅니다. 프로 또는 항 염증 인자의 분비를 포함하여 다른 활성 상태는, 신경 영양 분자와 리소좀의 활동 자료는 그 발현 시간에 따라 표현형 마커의 특정 패턴을 특징으로한다주변 환경의 진화. 손상된 뇌의 이러한 M / M의 표현형의 특성은 여전히 빈약하다. 우리는 뇌졸중 후 M / M 발현과 진화를 분석하는 pMCAo의 잘 확립 된 쥐 모델을 사용했다. 여기에 제시된 면역 형광 기반의 프로토콜은 특정 M / M 표현형 마커, 현지화 및 허혈성 지역에서 휴대 공동 식의 모양에 대한 통찰력을 얻기를 목표로하고 있습니다. 우리는 다른 활성화 상태 또는 표현형에 관련된 몇 가지 분자를 조사, 즉 CD11b를, 백혈구 및 M / M의 활성화 / 모집 6-8의 널리 사용되는 마커로 표시되는 표면 마커 CD68 리소좀 6,7 및 YM1 분비의 마커 단백질을 선택적으로 활성화 (M2) 대 식세포에 의해 표현 및 복구 기능 복원 9-10에 관련된.
두 개의 마커가 동일한 셀에 의해,하지만 서로 다른 세포 내 구획으로 표현 될 때, 혼자 colocalization을 많이 INF하지 않을 수 있습니다ormative. 이 경우, 동시 발현의 분석은 하나의 평면 뷰를 사용하여 입체 렌더링에서 수행 될 수있다. 우리는 여기에서 마커 동시 발현의 철저한 입체 분석을 얻기 위해 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에서 허혈 영역 (더 자세한 분석을 위해 심판 6 참조)에 M / M 표현형 마커의 현지화 및 공동 발현을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 초점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 세 가지 차원 공 촛점 이미징 M / M 활성화의 관련 마커의 특정 염색을 결합한다. 항체, 혈청 희석 작업을 fluorconjugated의 미세 조정은 조사 마커 잡음 비율로 최?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
스테파노 Fumagalli는 Monzino 재단의 동료입니다.
Materials
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| Hoechst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. |
Referências
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