Permeabilisering af adhæreret celler under anvendelse af en inertgas Jet
Summary
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til midlertidig permeabilisering af adhærerende celler ved anvendelse af en inert gas jet. Denne teknik letter overførsel af genetisk materiale og biomolekyler i adhærente mammale celler ved anvendelse af mekaniske kræfter til at forstyrre plasmamembranen.
Abstract
Findes forskellige Celletransfektion teknikker, og disse kan opdeles i tre hovedkategorier: viral, kemiske og mekaniske. Denne protokol beskriver en mekanisk metode til tidsmæssigt permeabilisere adhærente celler under anvendelse af en inert gas jet, der kan lette overførsel af normalt ikke-permeable makromolekyler i celler. Vi mener, at denne teknik virker ved at bibringe forskydningskræfter på plasmamembranen af adhærente celler, hvilket resulterer i den midlertidige dannelse af mikroporer. Når disse porer er oprettet, cellerne derefter permeabel for genetisk materiale og andre biomolekyler. De mekaniske kræfter involveret løber en risiko for permanent beskadige eller adskillelse af celler fra deres substrat. Der er derfor et snævert udvalg af inerte gasdynamik hvor teknikken er effektiv. En inert gas jet har vist sig effektive til permeabilisering forskellige adhærente cellelinjer, herunder HeLa, HEK293 og menneskelige abdominale aorta endotelceller. Denne protokol er egnet til permeabilization af adhærente celler både in vitro og, som vi har vist in vivo, viser den kan anvendes til forskning og potentielt i fremtidige kliniske anvendelser. Det har også den fordel, at permeabiliserende celler i et rumligt restriktivt, hvilket kan vise sig at være en værdifuld forskning værktøj.
Introduction
Med udviklingen af biomedicin og forståelsen af celle mekanik, har levering af biomolekyler i celler bliver afgørende for mange forskningsområder og medicinske behandlinger. Forskellige teknikker er blevet udviklet til at indføre fremmede molekyler gennem plasmamembranen og ind i cellecytosolen. Disse kan generelt klassificeres som enten viral, kemiske eller mekaniske teknikker. Viral teknikker kan transficere genetisk materiale, såsom RNA og DNA ved anvendelse af virale vektorer 1. Virale teknikker tendens til at have høje virkningsgrader i visse cellelinjer, men de har potentiale for immune og inflammatoriske reaktioner 2. Almindelige kemiske transfektionsfremgangsmåder indbefatter udfældning med calciumphosphat 3 bakterielle exotoksiner 4 og lipofektion 5. Disse teknikker har vist sig at være effektive, men der opstår visse problemer, såsom celletoksicitet og ikke-specificitet. Endvidere teknikker såsom calcium phosphate udfældning er blevet fundet at have transfektionseffektiviteten op til 70%, men kun i visse cellelinier, sjældent i primære celler 6. Dette er noten som stigende forskningsindsats bliver sat i primære celler, især i tilfælde af at designe forskellige behandlinger til klinisk brug og undersøgelse af DNA-funktion.
Temporal afbrydelse af cellemembranen ved mekanisk stimuli er et alternativ til indføring af fremmede molekyler i celler. Teknikker indbefatter: mikroinjektion af molekyler 7, elektroporering ved anvendelse af et elektrisk felt til at forstyrre membranen 8,9, sonoporation hjælp ultralydbølger at forstyrre cellemembranen 10-12, partikelbombardement som det fremgår af "gen-gun", som skyder partikler bundet med gener i cellen 13, og mere for nylig, anvendelsen af væske shear stress, der har vist sig at timeligt permeabilisere pattedyrceller 14,15. Selvom mekanikeral metoder undgå nogle af de førnævnte problemer, er de typisk ledsaget af lavere effektivitet og meget komplekse og specialiserede opsætninger. En atmosfærisk afgangstryk glød fakkel (APGD-t) blev udviklet på McGill med det oprindelige mål om functionalizing overflader og aftagning adhærente celler in vitro 16. Lykketræf, blev det opdaget, at en live / dead plet bliver brugt en eller anden måde blev taget i af celler uden en permeabiliserende agent bliver tilføjet. Desuden er denne syntes at have forekom kun i begrænsede områder af brøndene, der skete for at matche op med faklen sti. Undersøgelse af permeabilization kapaciteter APGD-t fortsatte, og i kontrol studier, blev det konstateret, at transportøren inaktiv gas jet af plasma uden excitation var også i stand til at permeabilisere celler. Dette modsiges den indledende hypotese, at de reaktive arter skabt af plasma jet midlertidigt nedsat funktion membranen og foreslog, at blot de mekaniskecal styrker var tilstrækkelig til at forårsage celle permeabilization. Herfra undersøgelser fortsatte i vores laboratorium for at forsøge at kvantificere og karakterisere permeabilization effektiviteten af en inaktiv gas jet samt kig på dens transfektionsforsøg kapaciteter 16.
Gennem disse undersøgelser har det vist sig, at mikroporer faktisk udgør i plasmamembranen, og disse porer har tendens til at genforsegle inden for ca 5 sek 15. Vi har vist, at teknikken anvendelighed in vitro og in vivo i fosterhinder en kyllingeembryo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inert gas jet permeabilization er en nyttig teknik til Tilhænger celletransfektion. Det giver mulighed for at overføre biomolekyler i celler med anvendelse af mekaniske kræfter, som eliminerer behovet for potentielt skadelige kemikalier eller virale vektorer. Teknikken kan potentielt giver forskere og klinikere en effektiv og relativt enkel måde til præcist at transficere celler. Selektivitet permeabilization er også unik muligt for forskerne at kun behandle bestemte celler i en enkelt koloni, som kunne være nytt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke følgende finansieringskilder: Canadisk Institutes of Health Research (CIHR), naturvidenskab og Engineering Research Council (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Referências
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans–immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
