Perméabilisation des cellules adhérant à l'aide d'un gaz inerte Jet
Summary
Ce protocole décrit un procédé pour la perméabilisation temporaire de cellules adhérentes au moyen d'un jet de gaz inerte. Cette technique facilite le transfert de matériel génétique et de biomolécules dans des cellules de mammifères adhérentes par l'utilisation des forces mécaniques pour rompre la membrane de plasma.
Abstract
Diverses techniques de transfection cellulaire existent et peuvent être décomposés en trois grandes catégories: virale, chimiques et mécaniques. Ce protocole décrit un procédé mécanique pour perméabiliser les cellules adhérentes dans le temps au moyen d'un jet de gaz inerte qui peut faciliter le transfert de macromolécules normalement non-perméables dans des cellules. Nous croyons que cette technique fonctionne en transmettant des forces de cisaillement sur la membrane plasmique des cellules adhérentes, ce qui entraîne la formation de micropores temporaire. Une fois que ces pores sont créés, puis les cellules sont perméables à du matériel génétique et d'autres biomolécules. Les forces mécaniques impliquées ne courent le risque de cellules en permanence endommager ou de détachement de leur support. Il est, par conséquent, une gamme étroite de la dynamique des gaz inertes où la technique est efficace. Un jet de gaz inerte, s'est avérée efficace pour la perméabilisation de diverses lignées cellulaires adhérentes, y compris les cellules HeLa, HEK293 et des cellules endotheliales aortiques abdominaux humains. Ce protocole est approprié pour la permeabilization de cellules adhérentes à la fois in vitro et, comme nous l'avons démontré, in vivo, montrant qu'il peut être utilisé pour la recherche et potentiellement dans de futures applications cliniques. Il a aussi l'avantage de perméabilisation des cellules d'une manière restrictive l'espace, ce qui pourrait s'avérer un précieux outil de recherche.
Introduction
Avec l'évolution de la biomédecine et la compréhension de la mécanique des cellules, la livraison de biomolécules dans les cellules est devenu vital pour de nombreux domaines de recherche et les traitements médicaux. Différentes techniques ont été mises au point pour introduire les molécules étrangères à travers la membrane plasmique et dans le cytosol de la cellule. Ceux-ci peuvent généralement être classés comme étant soit: techniques virales, chimiques ou mécaniques. Techniques virales peuvent transfecter matériel génétique tel que l'ARN et de l'ADN en utilisant des vecteurs viraux 1. Techniques virales ont tendance à avoir des rendements élevés dans certaines lignées cellulaires, mais ils ont le potentiel pour les réactions immunitaires et inflammatoires 2. Procédés de transfection chimique communs comprennent la précipitation au phosphate de calcium 3, les exotoxines bactériennes 4 et 5 lipofection. Ces techniques se sont révélées être efficaces, cependant, certains problèmes se posent tels que la toxicité cellulaire et la non-spécificité. En outre, des techniques telles que phosphat de calciume précipitations ont été trouvés pour avoir des efficacités de transfection allant jusqu'à 70%, mais seulement dans certaines lignées cellulaires, rarement dans des cellules primaires 6. C'est la note que l'augmentation des efforts de recherche sont mis dans des cellules primaires, en particulier dans le cas de la conception de divers traitements pour une utilisation clinique et l'étude du fonctionnement de l'ADN.
Perturbation temporelle de la membrane cellulaire par l'intermédiaire des stimuli mécaniques est une alternative pour introduire des molécules dans des cellules étrangères. Les techniques comprennent: une micro-injection des molécules 7, électroporation en utilisant un champ électrique pour rompre la membrane de 8,9, sonoporation utilisant des ondes ultrasonores pour perturber la membrane cellulaire de 10 à 12, le bombardement de particules tel que démontré par le «canon à gènes», où l'on tire des particules liées avec gènes dans la cellule 13, et, plus récemment, l'application d'une contrainte de cisaillement de fluide qui a été montré pour perméabiliser des cellules de mammifères 14,15 temporellement. Bien que mécanicienméthodes al éviter certains des problèmes mentionnés ci-dessus, ils sont généralement accompagnés par une efficacité moindre et des configurations très complexes et spécialisés. Une torche à décharge luminescente à la pression atmosphérique (APGD-t) a été développé à l'Université McGill dans le but initial de la fonctionnalisation de surfaces et de détacher les cellules adhérentes in vitro 16. Par un heureux hasard, il a été découvert qu'une tache vivants / morts a été utilisé en quelque sorte d'être pris en charge par les cellules sans agent de perméabilisation est ajouté. En outre, cela semblait n'avoir eu lieu que dans les zones réglementées des puits qui ont eu lieu à correspondre avec le chemin de la torche. Enquête sur les capacités de perméabilisation de la APGD-t continué et dans les études de contrôle, il a été constaté que le support inerte jet de plasma sans excitation de gaz a également été en mesure de perméabiliser les cellules. Cela contredit l'hypothèse initiale selon laquelle les espèces réactives créées par le jet de plasma perturbés temporairement la fonction de la membrane et a suggéré que simplement les mécaques forces étaient suffisantes pour provoquer la perméabilisation de la cellule. De là, les études poursuivies dans notre laboratoire pour tenter de quantifier et de caractériser l'efficacité de perméabilisation d'un jet de gaz inerte ainsi que regarder ses capacités de transfection 16.
Grâce à ces études, il a été trouvé que des micropores font sous forme de fait dans la membrane plasmique, et ces pores ont tendance à refermer au sein d'environ 5 sec 15. Nous avons démontré l'utilité de la technique in vitro et in vivo dans la membrane chorioallantoïque d'un embryon de poulet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jet de gaz inerte perméabilisation est une technique utile pour la transfection de cellules adhérentes. Il offre la possibilité de transférer des biomolécules dans des cellules à l'aide de forces mécaniques, ce qui élimine le besoin pour des produits chimiques potentiellement nocives ou des vecteurs viraux. La technique pourrait permettre aux chercheurs et aux cliniciens un moyen efficace et relativement simple pour la transfection des cellules précisément. La sélectivité de la perméabilisation est éga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes: Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), les Sciences naturelles et du Conseil de recherches en génie (CRSNG).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Referências
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