Permeabilização de células aderidas Usando um gás inerte Jet
Summary
Este protocolo descreve um método para a permeabilização temporária de células aderentes utilizando um jacto de gás inerte. Esta técnica facilita a transferência de material genético e biomoléculas em células de mamíferos aderentes por meio da utilização das forças mecânicas para romper a membrana de plasma.
Abstract
Existem várias técnicas de transfecção celular e estes podem ser divididos em três categorias principais: virais, químicas e mecânicas. Este protocolo descreve um método mecânico para temporalmente permeabilizar as células aderentes utilizando um jacto de gás inerte, que pode facilitar a transferência de normalmente macromoléculas não permeáveis nas células. Acreditamos que esta técnica funciona por transmissão de forças de cisalhamento sobre a membrana plasmática de células aderentes, resultando na formação temporária de microporos. Uma vez que esses poros são criadas, as células são, então, permeável ao material genético e outras biomoléculas. As forças mecânicas envolvidas não correr o risco de danificar as células permanentemente ou desencaixar do seu substrato. Existe, portanto, uma estreita faixa de dinâmica de gás inerte, onde a técnica é eficaz. Um jato de gás inerte mostrou-se eficaz na permeabilização várias linhas celulares aderentes incluindo HeLa, HEK293 e células endoteliais da aorta abdominal humanos. Este protocolo é apropriado para a permeabilization de células aderentes, quer in vitro e, como aqui demonstrado, in vivo, mostrando que pode ser utilizado para a pesquisa e, potencialmente, em aplicações clínicas futuras. Tem também a vantagem de permeabilização de células de uma forma espacialmente restritiva, que poderia revelar-se uma ferramenta de pesquisa valiosa.
Introduction
Com a evolução da biomedicina e da compreensão da mecânica de células, a entrega de biomoléculas em células tornou-se vital para muitos campos de pesquisa e terapias médicas. Diferentes técnicas têm sido desenvolvidas para introduzir moléculas estranhas através da membrana do plasma e para dentro do citoplasma celular. Estes podem ser geralmente classificadas como: técnicas virais, químicos ou mecânicos. Técnicas virais podem transfectar material genético tais como ARN e ADN utilizando vectores virais 1. Técnicas virais tendem a ter alta eficiência em certas linhagens de células, no entanto, eles têm o potencial para reações imunes e inflamatórias 2. Métodos de transfecção químicos comuns incluem precipitação com fosfato de cálcio de 3, 4 e exotoxinas bacterianas lipofecção 5. Estas técnicas têm provado ser eficaz, no entanto, certos problemas surgem, tais como toxicidade da célula e não especificidade. Além disso, as técnicas tais como o cálcio phosphate precipitação foram encontrados a ter eficiências de transfecção superior a 70%, mas apenas em certas linhas celulares, raramente em células primárias 6. Isto é digno de nota que cada vez mais esforços de pesquisa são colocados em pilhas, em especial no caso da concepção de vários tratamentos para uso clínico e o estudo do ADN funcionamento.
Temporal rompimento da membrana celular através de estímulos mecânico é uma alternativa para a introdução de moléculas estranhas nas células. As técnicas incluem: microinjecção de moléculas 7, electroporação usando um campo eléctrico para romper a membrana de 8,9, sonoporação usando ondas de ultra-sons para romper a membrana de células 10-12, bombardeamento de partículas, como revelado no "pistola de genes", que dispara partículas ligadas com genes na célula 13, e, mais recentemente, a aplicação de tensão de corte do fluido que tem sido demonstrado que temporalmente permeabilizar as células de mamíferos 14,15. Embora mecânicométodos al evitar alguns dos problemas acima mencionados, eles são normalmente acompanhadas por eficiências menores e configurações muito complexas e especializadas. Uma tocha de descarga luminescente pressão atmosférica (APGD-t) foi desenvolvido na McGill, com o objetivo inicial de funcionalização de superfícies e retirar células aderentes in vitro 16. Por acaso, descobriu-se que uma mancha vivo / morto sendo usado foi de algum modo a ser levado por células sem um agente de permeabilização ser adicionado. Além disso, esta parecia ter ocorrido apenas em áreas restritas dos poços, que aconteceram a corresponder-se com o caminho da tocha. A investigação sobre as capacidades de permeabilização da APGD-t contínua e em estudos de controlo, verificou-se que o jacto de gás veicular inerte do plasma sem excitação, também foi capaz de permeabilizar as células. Isto contradiz a hipótese inicial de que as espécies reativas criadas pelo jato de plasma prejudicada temporariamente a função da membrana e sugeriu que simplesmente os mecânicosforças cal foram suficientes para causar a permeabilização celular. A partir daqui, os estudos continuaram em nosso laboratório para tentar quantificar e caracterizar a eficiência de permeabilização de um jato de gás inerte, bem como olhar para as suas capacidades de transfecção 16.
Através destes estudos, verificou-se que os microporos façam efectivamente na membrana do plasma, e estas tendem a selar os poros dentro de aproximadamente 5 seg 15. Demonstrámos a utilidade do cultivo in vitro e in vivo na membrana corioalantóica de um embrião de pinto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inerte permeabilização jato de gás é uma técnica útil para a transfecção de células aderentes. Ele oferece a capacidade de transferir biomoléculas para as células com a utilização de forças mecânicas, o que elimina a necessidade de produtos químicos potencialmente nocivos ou vectores virais. A técnica poderia dar aos pesquisadores e clínicos de forma eficiente e relativamente simples de transfecção com precisão células. A seletividade da permeabilização também é único permitindo que os pesquis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer às seguintes fontes de financiamento: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), as ciências naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Referências
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