التحكم الكمي والزمني للأكسجين المكروية في جزيرة واحدة المستوى
Summary
السيطرة الأكسجين ميكروفلويديك يمنح أكثر من مجرد الراحة والسرعة على غرف ميتة لإجراء تجارب بيولوجية. خصوصا عندما نفذت عبر نشر عبر غشاء، يمكن توفير الأكسجين السائل ميكروفلويديك المتزامن والتحويرات المرحلة الغاز على مستوى الميكروسكيل. هذه التقنية تتيح ديناميكية تجارب متعددة حدودي الحرجة لدراسة جزيرة الفيزيولوجيا المرضية.
Abstract
الأوكسجين في وقت واحد ورصد العوامل اقتران تحفيز إفراز الجلوكوز في تقنية واحدة هو أمر حاسم لنمذجة الدول المرضية في جسم المريض من جزيرة نقص الأكسجة، وخاصة في بيئات زرع. تقنيات غرفة ميتة قياسي لا يمكن أن تعدل كل من التحفيز في نفس الوقت ولا توفر مراقبة الوقت الحقيقي من العوامل اقتران تحفيز إفراز الجلوكوز. لمعالجة هذه الصعوبات، طبقنا تقنية ميكروفلويديك متعدد الطبقات لدمج كلا مائي والتحويرات المرحلة الغاز عبر غشاء نشرها. وهذا يخلق شطيرة التحفيز في جميع أنحاء الجزر microscaled داخل polydimethylsiloxane شفافة (PDMS) الجهاز، مما يتيح رصد العوامل المذكورة آنفا عن طريق اقتران مضان المجهري. بالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم في إدخال الغاز بواسطة زوج من microdispensers، وتوفير، التحويرات دقيقة الفرعية الكمية من الأوكسجين بين 0-21٪. يتم تطبيق هذا نقص الأكسجين متقطع للتحقيق في ظاهرة جديدة من جزيرةر شروط مسبقة. وعلاوة على ذلك، مسلحة مع المجهري المتعدد الوسائط، استطعنا أن ننظر إلى الكالسيوم مفصلة وديناميات قناة K ATP خلال هذه الأحداث ميتة. نحن نتصور نقص الأكسجة ميكروفلويديك، وخاصة المرحلة المزدوجة هذه التقنية في وقت واحد، وأداة قيمة في دراسة الجزر فضلا عن العديد من أنسجة الجسم الحي السابقين.
Introduction
نقص الأكسجة ديناميكية المهم في البيولوجيا، وتحديدا لزرع جزيرة
نقص الأكسجة ديناميكية هو الفسيولوجية الهامة وكذلك المعلمة المرضية في جسم المريض في العديد من الأنسجة البيولوجية. التغيير في الأكسجين، على سبيل المثال، هو إشارة قوية التنموية في الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، الأنماط المكانية والزمانية في نقص الأكسجة تعدل HIF1 ألفا وتلعب دورا في أمراض مثل سرطان البنكرياس. نقص الأكسجين هو أيضا عامل التباس مؤثرة على نتائج زرع جزيرة. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت زمنيا التذبذبات من نقص الأكسجة، أو نقص الأكسجة متقطعة (IH) الفوائد في "شروط مسبقة" الجزر 1. ومع ذلك، آثار نقص الأكسجين على حد سواء ثابتة وعابرة على جزيرة علم وظائف الأعضاء لديها حتى الآن يجب أن يفهم جيدا أو درس، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود الأدوات المناسبة للسيطرة على جزيرة في المكروية.
وأوعية دموية الجزر بشكل جيد في الجسم الحي
الجزر البنكرياسية هي 50-400 المجاميع م كروي من خلايا الغدد الصماء، بما في ذلك خلايا بيتا وألفا الخلايا التي هي المسؤولة عن توازن الجلوكوز؛ 56. عندما تتعرض الجزر إلى الجلوكوز تنشيطية في الدم، وامتصاص تحلل يؤدي إلى إنتاج ATP، والذي يفتح البوتاسيوم ATP-الحساسة (K ATP) القنوات والنتائج في تدفق الكالسيوم الذي يقوم بتشغيل إيماس من حبيبات الأنسولين. الأكسجين مهم لدفع هذه العملية الأيضية بشكل كبير ويتأثر افراز الانسولين بشكل كبير من قبل ديناميكية تدفق الدم والأوكسجين، بالإضافة إلى تدرجات الجلوكوز. الجزر أداء بسهولة هذا الرد على الأنسولين الجلوكوز في الجسم الحي كما و perfused غاية في البنكرياس، كل في طول خلية واحدة من وعاء الشعرية. ومع ذلك، تتم إزالة شبكة كثيفة من الشعيرات الدموية intraislet بواسطة كولاجيناز خلال جزيرة العزلة 2،3. بالتالي، مقيدة سواء الأوكسجين والمغذيات الإمدادات إلى 100 ميكرومتر محيط بسبب القيود نشرها.
خطوة "> التقنيات الحالية حدت النجاح في إعادة جزيرة المكرويةالأوكسجين والجلوكوز ديناميات إعادة جزيرة في الأم، المفتاح لنمذجة الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، من الصعب تحقيق مع الغرف ميتة القياسية التي تتطلب تدفق تفصيلا ويفتقر الرصد المستمر للوظائف جزيرة. علاوة على ذلك، علاجات زرع للنوع الأول من مرض السكري فضح الجزر المعزولة لنقص الأكسجين في النظام البابي الكبدي 4 التي لديها أقل بكثير ص 2 (<2٪، 5-15 ملم زئبقي) مقابل البنكرياس الفسيولوجية (5.6٪، 40 مم زئبق). بعد الزرع، الطعوم جزيرة يستغرق أسبوعين أو أكثر إلى أن revascularized. وقد ثبت أن التعرض ميتة يضعف الجلوكوز الأنسولين آلية اقتران جزيرة ل. من بين العوامل تحفيز إفراز اقتران، إشارات الكالسيوم وإمكانات الميتوكوندريا، والأنسولين حركية يمكن بسهولة رصدها باستخدام على microfluidics. أظهرت أسلوبنا ميكروفلويديك السابقة هذا إعادةمراقبة آل الوقت مع التشكيل الدقيق للالمكروية مائي حول جزيرة واحدة 5،6. ومع ذلك، يتم وضع حرج الكمي من ضعف ميتة جزيرة عن طريق عدم وجود التحفيز ورصد التقنيات في وقت واحد. وبالتالي، والجمع بين السيطرة ميكروفلويديك الأكسجين ورصد جزيرة يمكن أن تحسن الدراسات نقص الأكسجة جزيرة.
يمكن على microfluidics إعادة وتعدل المكروية المائية والأكسجين
وقد استند تقنية قياسية للأنسجة والثقافة نقص الأكسجة دراسات عن غرف ميتة. بشكل عام، غرف ميتة توفر تركيزات الأكسجين واحدة مع موازنة مرات في ~ 10-30 دقيقة، تتعارض مع تحجيم دقيقة نقص الأكسجة الحيوية. استخدام اثنين من الدراسات الحديثة غرف مخصصة صغيرة لنقص الأكسجة التعرض المتقطع على الفئران كله، وكانت النتائج متضاربة بشأن الناجم عن استجابة الأنسولين الجلوكوز 7،8. نضع في اعتبارنا أنه في مستوى الحيوان كله، والأكسجين متنفس ليس تران مباشرةمن المقرر أن جزيرة بو الشعرية 2، وذلك بسبب التحكم في الجهاز التنفسي. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الدراسات لم يكن لديك مستويات الأكسجين موحدة، كما أنها لا توفر تدابير في الوقت الحقيقي على مستوى الأنسجة من الجزر.
من ناحية أخرى، يمكن على microfluidics الأكسجين تجاوز هذه القيود عن طريق التحكم الأكسجين عبر شبكات قناة الغاز. علاوة على ذلك، على microfluidics متوافق مع التصوير الحي خلال التشكيل الأكسجين، وهو انجاز غير ممكن حاليا مع الغرف ميتة القياسية. وهناك عدد من هذه الرواية على microfluidics نهج الاستفادة من نفاذية الغاز من polydimethylsiloxane بحل تركيزات الأكسجين في microchannels التي تتدفق عبر وسائل الاعلام الخلايا المستهدفة 9-14. هذه الأجهزة أيضا دمجت عدة تركيزات الأكسجين منفصلة، مضان مقرها أجهزة الاستشعار الأوكسجين، وحتى توليد الأوكسجين الكيميائي على رقاقة.
على microfluidics القائم على انذياب السائل يجدون صعوبة في الحفاظ على الاستقرار، التدرجات مستمر كما قلتر يعتمد على خلط الحمل الحراري وهي حساسة في التدفق الظروف. في المقارنة، والتقنية التي نستخدمها هنا يركز على خفض مسار انتشار تسليم الأوكسجين. يتم القضاء على انذياب الغاز وتدفق القص عن طريق نشرها مباشرة الأكسجين عبر غشاء المصنف مع الخلايا أو الأنسجة جزيرة. هذا يزيل على microfluidics الإضافية المطلوبة للسيطرة على انذياب ويمنع إجهاد القص لا لزوم لها على الجزر، والتي يمكن أن تؤدي في حد ذاته إفراز الأنسولين. وقد استخدم هذا المنبر لإظهار أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) يصل التنظيم في كلا النقيضين مفرط التأكسج ونقص الأوكسجين (2-97٪ O 2) في خلية ثقافة 1،15. بسبب التسليم المباشر من الأكسجين وإزالة تدفق القص، وبرنامجنا القائم على نشر يوفر الحل الأمثل لدراسة ميكروفلويديك جزيرة نقص الأكسجة.
التحفيز متعدد الوسائط والرصد
يجلب على microfluidics القائم على نشر أيضا فوائد إضافية عند تكييفها لدراسة ميل جزيرةcrophysiology. باستخدام غشاء كحاجز نشرها، السائل يمكن أن تكون معزولة من التحويرات الأكسجين، مما يتيح التحكم من التحفيز الجلوكوز مائي مستقل من التحفيز ميتة. وهذا يخلق مثل شطيرة التحفيز المتزامنة التي مكانيا التسليم نقطة دبوس إلى الجزر. علاوة على ذلك، كما هو التضمين الغاز زمنيا عبر microinjectors المحوسبة، يمكننا أن تعدل تركيز الأكسجين 21-0٪ رقميا مع الوقت عابر أقل من 60 ثانية. عناصر التحكم الديناميكي من الأكسجين والجلوكوز المكروية في المجهر تسمح في الوقت الحقيقي بروتوكول المتعدد الوسائط التي لن يكون من الممكن أو مرهقة للغاية باستخدام غرف ميتة القياسية. باستخدام هذا الجهاز، تم رصد إشارات الكالسيوم (FURA-AM)، إمكانات الميتوكوندريا (رودامين 123)، وحركية الأنسولين (ELISA) لتوفير صورة كاملة للاستجابة الديناميكية الجلوكوز الأنسولين تحت نقص الأكسجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
طرائق متعددة متكاملة في هذا الأسلوب جزيرة نقص الأكسجة الحاضر عدة نقاط لاحظ هنا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أول مواصلة الجزر المعزولة أن تتحلل وتتفكك في الثقافة بسبب الانزيمات الهاضمة من خلايا عنيبية. توحيد التجارب ل1-2 أيام بعد جزيرة العزلة وبالتالي حاسما في الحصول ع?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 DK091526 (JO)، جبهة الخلاص الوطني 0852416 (DTE)، ومشروع شيكاغو للسكري.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
Referências
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP – Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
