微流控氧赋予的不仅仅是方便和速度超过低氧室的生物实验。通过扩散穿过膜实现的,特别是当,微氧可以在微尺度级同时提供液相和气相的调制。这项技术使动态多参数实验的关键学习islet病理生理学。
同时氧化葡萄糖刺激分泌耦合系数在一个单一的技术和监测是模拟胰岛缺氧的病理生理状态的关键,尤其是在移植环境。同时标准的缺氧室技术无法调节两个刺激,也不提供葡萄糖刺激分泌耦合系数的实时监控。为了解决这些问题,我们应用了多层微流控技术,通过扩散膜水性和气相调制集成。这将创建在周围的透明聚二甲基硅氧烷(PDMS)设备的microscaled胰岛刺激夹层,可以监控通过荧光显微镜前述的耦合因素。此外,气体输入由一对微分配器的控制,提供了定量,分分钟之间0-21%氧气的调制。这种间歇性缺氧是适用于调查小岛的一个新现象吨预处理。此外,手持多式联运显微镜,我们能够在这些缺氧事件来看看详细的钙和K ATP通道的动态。我们设想微缺氧,特别是这个同步双相位技术,如胰岛细胞研究以及许多离体组织的重要工具。
动态缺氧是很重要的生物学,专为胰岛移植
动态缺氧是一种重要的生理,以及在许多生物组织的病理生理参数。变化中的氧,例如,是在血管生成一种强效的发育信号。此外,在缺氧的空间和时间模式调节HIF1-α,像胰腺癌疾病中发挥作用。缺氧也是影响胰岛移植结果的混杂因素。近日,缺氧,或间歇性低氧(IH)的时间上振荡“预处理”小岛1展示了好处。然而,胰岛生理静态和暂态缺氧的影响还没有得到很好的理解或学习,主要是由于缺乏适当的工具来控制胰岛的微环境。
胰岛血管化以及在体内
胰岛是50-400 56;米球形聚集体内分泌细胞,包括β-细胞和α-细胞是负责葡萄糖稳态。当胰岛在血液中,摄取和糖酵解导致ATP的产生,这带来了ATP敏感性钾离子(K ATP)通道,并导致钙离子内流触发胰岛素颗粒的胞吐暴露于刺激的葡萄糖。氧气是很重要的,以驱动此沉重的代谢过程和胰岛素分泌显著由血流量和氧供应的动力除了葡萄糖梯度的影响。胰岛容易在体内内从毛细血管一个单元格的长度执行此葡萄糖-胰岛素反应,因为它们是高度灌注胰腺,每个。然而,密集的网络intraislet毛细血管被胶原酶期间胰岛分离2,3移除。因此,氧气和养分供应被约束到一个100微米的周长由于扩散限制。
在重建胰岛微环境的步骤“>目前的技术已经成功的限制重建胰岛的原生氧和葡萄糖动力学,关键建模的生理和病理生理条件下,很难达到与需要复杂的流量和缺乏连续监测的胰岛功能的标准低氧室中。此外,移植治疗I型糖尿病露出分离胰岛缺氧在肝门系统4相比,生理胰腺(5.6%,40毫米汞柱),其具有低得多的氧分压pO 2(<2%,5〜15毫米汞柱)。移植后的胰岛移植需要两个星期或更长时间来吻合血管。它已被证明,低氧损害胰岛的葡萄糖 – 胰岛素偶联机制。其中刺激分泌耦合系数,钙信号,线粒体潜力和胰岛素动力学可以很容易地监测使用微流体。我们以前的微流体技术证明了这一点再人的实时监控与周围单个胰岛5,6水微环境的精确调节。然而,胰岛的缺氧损伤的定量是由缺乏同时刺激和监测技术的阻碍。因此,结合氧和胰岛监测微流体控制可以改善胰岛缺氧的研究。
微流控可以重新和调节水和氧微环境
该标准技术组织和文化缺氧的研究是基于对缺氧室。在一般情况下,低氧室提供单独的氧浓度与平衡时间在〜10-30分钟,用分钟缩放动态缺氧不相容。最近的两项研究中使用自定义的小室用于对全小鼠间歇低氧暴露,对葡萄糖诱导的胰岛素反应7,8相互矛盾的结果。请记住,在整体动物水平,呼出氧气不能直接转录定于胰岛毛细血管氧分压 ,由于呼吸系统的控制。此外,这些研究并没有标准化的氧含量,也没有提供实时措施胰岛的组织水平。
另一方面,氧气微流体可以通过经由气体通道网络控制氧超过这些限制。此外,微流体与实时成像兼容的过程中氧气的调制,一个壮举目前无法与标准缺氧室。许多这些新的微流体方法利用聚二甲基硅氧烷的透气性溶解的氧气浓度成流媒体在靶细胞9-14微通道。这些器件还集成了多个分立的氧浓度,基于荧光氧传感器,甚至化学氧代芯片上。
液体溶剂化 – 基于微流控也很难保持稳定的,连续的梯度,因为我T依赖于对流混合是敏感的流动条件。相比较而言,我们在这里使用的技术专注于降低氧输送的扩散路径。气体溶剂化和剪切流是通过直接扩散穿过接种细胞或胰岛组织膜的氧消除。这消除控制溶剂化需要额外的微流体和防止不必要的剪切应力的小岛,它本身可以引发胰岛素的释放。该平台已经被用来证明活性氧(ROS)的上调在两个高氧和缺氧的极端(2-97%O 2)在细胞培养1,15。因为直接运送氧气和去除剪切流动的,我们的扩散型平台为研究胰岛缺氧的最佳微流体解决方案。
多式联运刺激和监控
基于扩散的微流体时改编为研究胰岛英里也带来了额外的好处crophysiology。通过使用膜作为扩散阻挡层,所述液体可从氧的调制进行分离,使之含水葡萄糖刺激的控制独立地选自缺氧的刺激。这将创建一个类似三明治的同时刺激在空间上针点送货到小岛。此外,由于气体经由计算机化microinjectors时间上调制的,我们可以从21-0%数字短暂时间小于60秒的调节氧气浓度。中的氧和葡萄糖的微环境在显微镜的动态控制允许实时多峰协议使用标准的低氧室那将是不可能的或极其麻烦的。使用这种装置,钙信号(的Fura-AM),线粒体电位(罗丹明123),和胰岛素动力学(ELISA)进行了监测,以提供在缺氧条件下的动态葡萄糖 – 胰岛素反应的全貌。
集成在这个小岛缺氧技术的多模式现在几点注意这里进行故障排除。首先,分离出的胰岛继续降解,在文化瓦解由于来自腺泡细胞消化酶。后胰岛分离标准化的实验来1-2天,因此,在获得一致的结果至关重要。第二,所述水性流缺氧和间歇性缺氧期间被停止,以防止对流的间隙在层流和扩散之间的边界。这似乎限制了胰岛预处理的持续时间。在水通道的气体交换未来整合可以消除这一微小的间隙?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由卫生部资助R01 DK091526(JO),美国国家科学基金会0852416(DTE)全国学院和芝加哥糖尿病项目的支持。
Reagent/Material | |||
Spinner | Laurell | WS-400 | |
SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
Fraction Collector | Gilson | 203 | |
Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | ||
Glucose | Sigma-Aldrich | ||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |