Kvantitative og Temporal Kontrol af ilt mikromiljø på det indre Islet Level
Summary
Microfluidic oxygen control confers more than just convenience and speed over hypoxic chambers for biological experiments. Especially when implemented via diffusion through a membrane, microfluidic oxygen can provide simultaneous liquid and gas phase modulations at the microscale-level. This technique enables dynamic multi-parametric experiments critical for studying islet pathophysiology.
Abstract
Samtidig iltning og overvågning af glucose stimulus-sekretionsfaktorer koblings faktorer i en enkelt teknik er afgørende for modellering patofysiologiske tilstande af holmen hypoxi, især hos transplanterede miljøer. Standard hypoxisk kammer teknikker kan ikke modulere både stimulationer på samme tid eller levere real-time overvågning af glucose stimulus-sekretionsfaktorer koblings faktorer. For at løse disse problemer, ansøgte vi et flerlaget mikrofluid teknik til at integrere både vandige og gasfase modulationer via en diffusion membran. Dette skaber en stimulation sandwich omkring microscaled holme i den transparente polydimethylsiloxan (PDMS)-enhed, hvilket muliggør overvågning af de førnævnte koblings faktorer via fluorescens mikroskopi. Derudover er gasindløbet styres af et par microdispensers, hvilket giver kvantitative, sub-øjebliks modulationer af ilt mellem 0-21%. Denne intermitterende hypoxi anvendes til at undersøge et nyt fænomen på øent prækonditionering. Desuden bevæbnet med multimodal mikroskopi, var vi i stand til at se på detaljeret calcium og K ATP kanal dynamik i disse hypoxiske begivenheder. Vi forestiller microfluidic hypoxi, især denne samtidige dual fase teknik, som et værdifuldt redskab i at studere holme samt mange ex vivo væv.
Introduction
Dynamisk hypoxi er vigtigt i biologi, specielt til ø-transplantationer
Dynamisk hypoxi er et vigtigt fysiologisk såvel som patofysiologisk parameter i mange biologiske væv. Ændring i oxygen, for eksempel, er en potent udviklingsmæssige signal i angiogenese. Desuden rumlige og tidslige mønstre i hypoxi modulere HIF1-alpha og spille roller i sygdomme som kræft i bugspytkirtlen. Hypoxia er også en forstyrrende faktor, der påvirker ø-transplantation resultater. For nylig har timeligt svingninger af hypoxi eller intermitterende hypoxi (IH) vist fordelene i "prækonditionering" øer 1. Imidlertid har både statiske og forbigående hypoxi effekter på holmen fysiologi endnu at blive forstået eller studeret, primært på grund af manglen på egnede redskaber til at kontrollere holm s mikromiljø.
Islets er godt vaskulariseret in vivo
Pancreasøer er 50-400 56. m kugleformede aggregater af endokrine celler, herunder beta-celler og alfa-celler, der er ansvarlige for glukose homøostase. Når øer er udsat for stimulerende glukose i blodet, optagelse og glycolyse fører til ATP-produktion, hvilket åbner op ATP-sensitive kalium (K ATP) kanaler og resulterer i calciumindløb der udløser exocytose af insulin granulat. Ilt er vigtigt at drive denne stærkt metaboliske proces og insulinsekretion er væsentligt påvirket af dynamikken i blodgennemstrømning og iltforsyning i tillæg til glukose gradienter. Islets let udføre denne glucose-insulin respons in vivo, da de er stærkt perfunderet i bugspytkirtlen, hver især inden for en celle længde fra et kapillært fartøj. Imidlertid er det tætte net af intraislet kapillærer fjernet ved collagenase under islet isolation 2,3. Derfor er både ilt og næringsstoffer leverer begrænset til en 100 um perimeter grund diffusionsbegrænsninger.
skridt "> Aktuelle teknikker har begrænset succes i at genskabe islet mikromiljøGenskabelse ø indfødte ilt og glukose dynamik, nøglen til at modellere fysiologiske og patofysiologiske forhold er vanskeligt at opnå med standard hypoxiske kamre, der kræver omfattende flow og mangler løbende overvågning af ø-funktioner. Desuden transplantation til behandling af type I diabetes udsætte isolerede øer på hypoksi i leverens portal system 4, som har meget lavere pO 2 (<2%, 5-15 mmHg) sammenlignet med fysiologisk bugspytkirtlen (5,6%, 40 mmHg). Post-transplantation, ø-podninger tage to uger eller mere at blive revaskulariseret. Det er blevet påvist, at hypoxisk eksponering svækker holm glukose-insulin kobling mekanisme. Blandt de stimulus-sekretion koblings faktorer, calcium signalering mitokondrie potentialer, og insulin-kinetik kan let overvåges ved hjælp mikrofluidik. Vores tidligere microfluidic teknik demonstrerede denne real-tid overvågning med præcis modulering af den vandige mikromiljø omkring enkelt ø 5,6. Dog er kvantificering af holmen er hypoxisk svækkelse forpurret af manglen på samtidige stimulation og overvågningsteknikker. Derfor kombinerer mikrofluid kontrol af ilt og holmen overvågning kan forbedre ø-hypoxi studier.
MicroFluidics kan genskabe og modulere den vandige og ilt mikromiljø
Standarden teknik til vævs-og kultur hypoxi studier har været baseret på hypoxiske kamre. Generelt hypoxisk kamre giver enlige iltkoncentrationer med ækvilibreringstider i ~ 10-30 min, der er uforenelige med minut-skaleret dynamisk hypoxi. To nylige undersøgelser brugte mindre tilpassede kamre til intermitterende hypoxi eksponering på hele mus, med modstridende resultater på glucose-induceret insulin respons 7,8. Husk på, at på hele dyret niveau, det indåndes ilt er ikke direkte trandømt til holmen kapillær pO 2, på grund kontrol i åndedrætsorganerne. Desuden har disse undersøgelser ikke har standardiserede iltindhold, heller ikke de giver real-time foranstaltninger på væv niveau holme.
På den anden side, kan oxygen mikrofluidik overgå disse begrænsninger ved at styre oxygen via gaskanal netværk. Desuden mikrofluidik er kompatibel med levende billeddannelse under ilt modulation, en bedrift i øjeblikket ikke muligt med standard hypoxisk kamre. En række af disse nye microfluidics nærmer udnytte gas gennemtrængelighed af polydimethylsiloxan at opløse iltkoncentrationer i microchannels der flyder medier via målceller 9-14. Disse enheder har også integreret flere diskrete iltkoncentrationer, fluorescens baseret ilt sensorer, og endda kemisk generation ilt on-chip.
Flydende solvatisering-baserede MicroFluidics har svært ved at opretholde stabile, kontinuerlige stigninger som jegt af konvektiv blanding, som er følsom til at flyde forhold. Til sammenligning, den teknik, vi bruger her fokuserer på at mindske udbredelsen vej ilttilførsel. Gassen solvatisering og shear flow elimineres ved direkte diffunderer ilt på tværs af en membran, podet med celler eller ø-væv. Dette fjerner de ekstra microfluidics er nødvendige for at kontrollere solvatisering og forhindrer unødige forskydningsspænding til holme, som i sig selv kan udløse insulin frigivelse. Denne platform er blevet brugt til at demonstrere reaktive ilt arter (ROS) opregulering på både hyperoxiske og hypoxisk ekstremer (2-97% O 2) i cellekultur 1,15. På grund af den direkte levering af ilt og fjernelse af forskydningsstrømningen vores diffusionsbaserede platform giver den optimale mikrofluid løsning for at studere islet hypoxi.
Multimodal stimulation og overvågning
Diffusion-baserede MicroFluidics bringer også yderligere fordele, når tilpasset til at studere ø microphysiology. Ved hjælp af en membran som en diffusionsbarriere, kan isoleres væsken fra oxygen modulationer muliggør kontrol af vandige glucose stimulationer uafhængigt af hypoxiske stimulationer. Dette skaber en sandwich-lignende samtidige stimulation som rumligt pin-point levering til holme. Desuden, som gassen tidsmæssigt moduleres via edb microinjectors, kan vi modulere iltkoncentrationen 21-0% digitalt med forbigående tid på mindre end 60 sek. De dynamiske kontrol af oxygen og glucose mikromiljø på mikroskopet muliggør en tidstro multimodal protokol, som ikke ville være muligt eller overordentligt besværlig anvendelse af standard hypoxiske kamre. Brug denne enhed blev calcium signalering (Fura-AM), mitokondrie potentialer (Rhodamin 123) og insulin kinetik (ELISA) overvåges for at give et fuldstændigt billede af det dynamiske glukose-insulin respons under hypoxi.
Protocol
Representative Results
Discussion
The multiple modalities integrated in this islet hypoxia technique present several points noted here for troubleshooting. First the isolated islets continue to degrade and disintegrate in culture due to digestive enzymes from acinar cells. Standardizing experiments to 1-2 days after islet isolation is thus critical in obtaining consistent results. Second, the aqueous flow was stopped during hypoxia and intermittent hypoxia to prevent convective clearance at the boundary between laminar flow and diffusion. This seems to l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE), and Chicago Diabetes Project.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
Referências
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP – Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
