सिंगल आइलेट स्तर पर ऑक्सीजन microenvironment के मात्रात्मक और अस्थायी नियंत्रण
Summary
Microfluidic ऑक्सीजन नियंत्रण जैविक प्रयोगों के लिए hypoxic कक्षों से अधिक सिर्फ सुविधा और गति की तुलना में अधिक प्रदान करता है. एक झिल्ली के माध्यम से प्रसार के माध्यम से लागू किया है, खासकर जब microfluidic ऑक्सीजन microscale स्तर पर एक साथ तरल और गैस चरण modulations प्रदान कर सकते हैं. इस तकनीक आइलेट pathophysiology के अध्ययन के लिए गतिशील बहु पैरामीट्रिक प्रयोगों महत्वपूर्ण सक्षम बनाता है.
Abstract
एक ही तकनीक में ग्लूकोज प्रोत्साहन स्राव युग्मन कारकों की एक साथ oxygenation और निगरानी विशेष रूप से प्रत्यारोपण के वातावरण में, आइलेट हाइपोक्सिया के pathophysiological राज्यों मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है. स्टैंडर्ड hypoxic कक्ष तकनीक एक ही समय में दोनों stimulations मिलाना न ही ग्लूकोज प्रोत्साहन स्राव युग्मन कारकों का वास्तविक समय की निगरानी प्रदान नहीं कर सकते. इन कठिनाइयों के समाधान के लिए, हम एक प्रसार झिल्ली के माध्यम से जलीय और गैस चरण modulations दोनों को एकीकृत करने के लिए एक बहुस्तरीय microfluidic तकनीक लागू होता है. इस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से aforementioned युग्मन कारकों की निगरानी को सक्षम, पारदर्शी polydimethylsiloxane (PDMS) डिवाइस के भीतर microscaled टापू के चारों ओर एक उत्तेजना सैंडविच बनाता है. साथ ही, गैस इनपुट 0-21% के बीच ऑक्सीजन की मात्रात्मक, उप मिनट modulations प्रदान करने, microdispensers की एक जोड़ी द्वारा नियंत्रित किया जाता है. इस रुक – रुक कर हाइपोक्सिया टापू की एक नई घटना की जांच के लिए लागू किया जाता हैटी शर्त. इसके अलावा, बहुविध माइक्रोस्कोपी के साथ सशस्त्र, हम इन hypoxic घटनाओं के दौरान विस्तृत कैल्शियम और कश्मीर एटीपी चैनल गतिशीलता को देखने में सक्षम थे. हम टापू का अध्ययन करने के साथ ही कई पूर्व vivo ऊतकों में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में, microfluidic हाइपोक्सिया, विशेष रूप से इस एक साथ दोहरी चरण तकनीक कल्पना.
Introduction
गतिशील हाइपोक्सिया विशेष रूप से आइलेट प्रत्यारोपण के लिए, जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण है
गतिशील हाइपोक्सिया कई जैविक ऊतकों में एक महत्वपूर्ण शारीरिक के साथ ही pathophysiological पैरामीटर है. ऑक्सीजन में परिवर्तित करें, उदाहरण के लिए, angiogenesis में एक शक्तिशाली विकास संकेत है. इसके अलावा, हाइपोक्सिया में स्थानिक और लौकिक पैटर्न HIF1 अल्फा मिलाना और अग्नाशय के कैंसर जैसे रोगों में भूमिका निभाते हैं. हाइपोक्सिया भी आइलेट प्रत्यारोपण परिणामों को प्रभावित करने वाले एक confounding कारक है. हाल ही में, हाइपोक्सिया, या रुक – रुक कर हाइपोक्सिया (एच) की अस्थायी दोलनों "शर्त" टापू 1 में लाभ का प्रदर्शन किया है. हालांकि, आइलेट शरीर क्रिया विज्ञान पर स्थिर और क्षणिक दोनों हाइपोक्सिया प्रभाव अच्छी तरह से मुख्य रूप से आइलेट के microenvironment नियंत्रित करने के लिए उपयुक्त उपकरणों की कमी के कारण या समझ का अध्ययन किया जाना बाकी है.
आइलेट्स अच्छी तरह vivo में vascularized रहे हैं
अग्नाशय islets 50-400 हैं 56, बीटा कोशिकाओं और ग्लूकोज homeostasis के लिए जिम्मेदार हैं कि अल्फा कोशिकाओं सहित अंत: स्रावी कोशिकाओं, के एम गोलाकार समुच्चय. टापू एटीपी संवेदनशील पोटेशियम (कश्मीर एटीपी) चैनलों और इंसुलिन कणिकाओं के एक्सोसाइटोसिस हो सके कि कैल्शियम बाढ़ में परिणाम खुल जो एटीपी उत्पादन, के लिए रक्त, तेज और ग्लाइकोलाइसिस नेतृत्व में उत्तेजक ग्लूकोज के संपर्क में हैं. आक्सीजन इस भारी चयापचय की प्रक्रिया को ड्राइव करने के लिए और इंसुलिन स्राव काफी ग्लूकोज ढ़ाल के अलावा रक्त प्रवाह और ऑक्सीजन की आपूर्ति की गतिशीलता से प्रभावित होता है महत्वपूर्ण है. वे अत्यधिक प्रत्येक, अग्न्याशय में perfused हैं के रूप में आइलेट्स आसानी से एक केशिका पोत से एक सेल लंबाई के भीतर विवो में इस ग्लूकोज इंसुलिन की प्रतिक्रिया करते हैं. हालांकि, intraislet capillaries के घने नेटवर्क आइलेट अलगाव 2,3 दौरान collagenase द्वारा हटा दिया जाता है. नतीजतन, ऑक्सीजन और पोषक तत्व दोनों की आपूर्ति के कारण प्रसार सीमाओं को एक 100 मीटर परिधि के लिए विवश कर रहे हैं.
आइलेट microenvironment पुनः बनाने में कदम "> वर्तमान तकनीक सीमित है सफलतापुनः आइलेट के मूल निवासी ऑक्सीजन और ग्लूकोज की गतिशीलता, शारीरिक और pathophysiological शर्तों मॉडलिंग की कुंजी, व्यापक प्रवाह की आवश्यकता होती है और आइलेट कार्यों की सतत निगरानी की कमी है कि मानक hypoxic कक्षों से हासिल करना मुश्किल है. इसके अलावा, प्रकार के प्रत्यारोपण के उपचारों मैं मधुमेह शारीरिक अग्न्याशय (5.6%, 40 एमएमएचजी) की तुलना में काफी कम पीओ 2 (<2%, 5-15 एमएमएचजी) है जो यकृत पोर्टल प्रणाली 4 में हाइपोक्सिया के लिए अलग टापू बेनकाब. बाद प्रत्यारोपण, आइलेट grafts revascularized होने के लिए दो सप्ताह या उससे अधिक ले. यह hypoxic जोखिम आइलेट के ग्लूकोज इंसुलिन युग्मन तंत्र कि impairs प्रदर्शन किया गया. प्रोत्साहन स्राव युग्मन कारकों, संकेत कैल्शियम, mitochondrial क्षमता, और इंसुलिन कैनेटीक्स के बीच आसानी से microfluidics उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. हमारे पिछले microfluidic तकनीक इस पुनः प्रदर्शन कियाअल समय एकल आइलेट 5,6 चारों ओर जलीय microenvironment के सटीक मॉडुलन के साथ निगरानी. हालांकि, आइलेट के hypoxic हानि की मात्रा का ठहराव एक साथ उत्तेजना और निगरानी तकनीक की कमी से stymied है. इसलिए, ऑक्सीजन और आइलेट निगरानी की microfluidic नियंत्रण के संयोजन आइलेट हाइपोक्सिया पढ़ाई में सुधार कर सकते हैं.
Microfluidics जलीय और ऑक्सीजन microenvironment विश्राम और न्यूनाधिक कर सकते हैं
ऊतक और संस्कृति हाइपोक्सिया के अध्ययन के लिए मानक तकनीक hypoxic कक्षों के आधार पर किया गया है. सामान्य में, hypoxic कक्षों मिनट पर पहुंचा गतिशील हाइपोक्सिया के साथ असंगत ~ 10-30 मिनट में संतुलन बार, साथ ही ऑक्सीजन सांद्रता प्रदान करते हैं. दो हाल के अध्ययनों से ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन प्रतिक्रिया 7,8 पर परस्पर विरोधी परिणामों के साथ, पूरे चूहों पर रुक – रुक कर हाइपोक्सिया जोखिम के लिए छोटे कस्टम कक्षों का इस्तेमाल किया. पूरे जानवरों के स्तर पर, respired ऑक्सीजन सीधे ट्रॅन नहीं है कि मन में रखिएकारण श्वसन प्रणाली में नियंत्रण करने के लिए, पो 2 केशिका आइलेट की उम्मीद. इसके अलावा, इन अध्ययनों मानकीकृत ऑक्सीजन का स्तर नहीं है, और न ही वे islets के ऊतक स्तर पर वास्तविक समय उपाय प्रदान करते हैं.
दूसरी ओर, ऑक्सीजन microfluidics गैस चैनल नेटवर्क के माध्यम से ऑक्सीजन को नियंत्रित करने से इन सीमाओं को पार कर सकते हैं. इसके अलावा, microfluidics, ऑक्सीजन मॉडुलन के दौरान मानक hypoxic कक्षों के साथ एक करतब फिलहाल संभव नहीं रहते इमेजिंग के साथ संगत है. इन उपन्यास microfluidics के एक नंबर लक्ष्य कोशिकाओं 9-14 से अधिक मीडिया प्रवाह कि microchannels में ऑक्सीजन सांद्रता भंग करने polydimethylsiloxane की गैस पारगम्यता उपयोग दृष्टिकोण. इन उपकरणों को भी कई असतत ऑक्सीजन सांद्रता, प्रतिदीप्ति आधारित ऑक्सीजन सेंसर, और पर चिप भी रासायनिक ऑक्सीजन पीढ़ी एकीकृत है.
लिक्विड solvation आधारित microfluidics मैं के रूप में एक कठिन समय स्थिर, निरंतर ढ़ाल को बनाए रखने के लिए हैटी स्थितियों के प्रवाह के प्रति संवेदनशील है जो संवहनी मिश्रण पर निर्भर करता है. इसकी तुलना में, हम यहाँ का उपयोग तकनीक ऑक्सीजन प्रसव के प्रसार पथ को कम करने पर केंद्रित है. गैस solvation और कतरनी प्रवाह सीधे कोशिकाओं या आइलेट ऊतकों के साथ वरीयता प्राप्त एक झिल्ली भर में ऑक्सीजन diffusing से समाप्त हो जाते हैं. इस solvation को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त microfluidics निकालता है और खुद इंसुलिन रिलीज ट्रिगर कर सकते हैं जो टापू, को अनावश्यक कतरनी तनाव को रोकता है. इस मंच प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ऊपर विनियमन सेल संस्कृति 1,15 में hyperoxic और hypoxic दोनों चरम सीमाओं (2-97% 2 हे) पर. क्योंकि ऑक्सीजन और कतरनी प्रवाह को हटाने के प्रत्यक्ष वितरण के, हमारे प्रसार आधारित प्लेटफॉर्म आइलेट हाइपोक्सिया के अध्ययन के लिए इष्टतम microfluidic समाधान प्रदान करता है.
मल्टीमॉडल उत्तेजना और निगरानी
आइलेट मील के अध्ययन के लिए अनुकूलित जब प्रसार आधारित microfluidics भी अतिरिक्त लाभ लाता हैcrophysiology. एक प्रसार बाधा के रूप में एक झिल्ली का उपयोग करके, तरल hypoxic stimulations से स्वतंत्र रूप से जलीय ग्लूकोज stimulations के नियंत्रण को सक्षम करने, ऑक्सीजन modulations से अलग किया जा सकता है. इस टापू को कि स्थानिक पिन अंक वितरण एक सैंडविच की तरह एक साथ उत्तेजना पैदा करता है. गैस अस्थायी कम्प्यूटरीकृत microinjectors माध्यम संग्राहक है के रूप में इसके अलावा, हम 60 सेकंड से भी कम समय क्षणिक समय के साथ डिजिटल रूप 21-0% से ऑक्सीजन एकाग्रता न्यूनाधिक कर सकते हैं. माइक्रोस्कोप में ऑक्सीजन और ग्लूकोज microenvironment के गतिशील नियंत्रण मानक hypoxic कक्षों का उपयोग संभव है या असाधारण बोझिल नहीं होगा कि एक वास्तविक समय बहुविध प्रोटोकॉल अनुमति देते हैं. इस उपकरण का उपयोग करना, कैल्शियम संकेतन (Fura-AM), mitochondrial क्षमता (Rhodamine 123), और इंसुलिन कैनेटीक्स (एलिसा) हाइपोक्सिया के तहत गतिशील ग्लूकोज इंसुलिन प्रतिक्रिया की एक पूरी तस्वीर प्रदान करने के लिए निगरानी की गई.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस आइलेट हाइपोक्सिया तकनीक में एकीकृत एकाधिक रूपरेखा मौजूद कई बिंदुओं समस्या निवारण के लिए यहाँ का उल्लेख किया. सबसे पहले पृथक टापू को नीचा दिखाना और कारण कोष्ठकी कोशिकाओं से पाचन एंजाइमों के लिए संस…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य अनुदान R01 DK091526 (जो), NSF 0852416 (DTE) के राष्ट्रीय संस्थानों, और शिकागो मधुमेह परियोजना द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
Referências
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP – Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
