Kvantitativ och Temporal Kontroll av syremikromiljö vid den inre Islet nivå
Summary
Mikroflödessyrekontroll ger mer än bara bekvämlighet och hastighet över hypoxiska kammare för biologiska experiment. Speciellt när förs via diffusion genom ett membran, kan mikroflödes syre ger samtidig vätska och gasfas modulationer på mikronivå. Denna teknik möjliggör dynamiska fler parametriska experiment kritiska för att studera holme patofysiologi.
Abstract
Samtidig syresättning och övervakning av glukos stimulus-sekrekopplingsfaktorer i en enda teknik är avgörande för modellering patofysiologiska tillstånd av holme hypoxi, speciellt i transplantations miljöer. Standard hypoxiska kammar tekniker kan inte modulera båda stimuli samtidigt och inte heller ger realtidsövervakning av glukos stimulus-sekrekopplingsfaktorer. För att lösa dessa problem, tillämpade vi en mångbottnad mikroflödessystem teknik för att integrera både vatten-och gasfas moduleringar via en diffusionsmembran. Detta skapar en stimulans smörgås runt microscaled holmar i den genomskinliga polydimetylsiloxan (PDMS) enhet, som möjliggör övervakning av de ovannämnda kopplingsfaktorer via fluorescensmikroskopi. Dessutom är ingångsgasen styrs av ett par microdispensers, ger kvantitativa, sub-minuten modulationer av syre mellan 0-21%. Denna intermittenta hypoxi används för att undersöka ett nytt fenomen på önt prekonditionering. Dessutom, beväpnade med multimodal mikroskopi, kunde vi titta på detaljerade kalcium och K ATP kanaldynamik under dessa hypoxiska händelser. Vi ser framför oss mikroflödes hypoxi, särskilt denna samtidiga dubbla fas teknik, som ett värdefullt verktyg för att studera holmar samt många ex vivo vävnader.
Introduction
Dynamisk hypoxi är viktigt i biologi, särskilt för holme transplantationer
Dynamisk hypoxi är en viktig fysiologisk och patofysiologisk parameter i många biologiska vävnader. Förändring av syre, till exempel, är en potent utvecklingssignal i angiogenes. Dessutom, rumsliga och tidsmässiga mönster i hypoxi modulera HIF1-alfa och spela roller i sjukdomar som cancer i bukspottkörteln. Hypoxia är också en påverkande faktor som påverkar holme transplantationsresultat. Nyligen har tidsmässigt svängningar av hypoxi, eller intermittent hypoxi (IH) visade fördelar i "prekonditionerande" holmar 1. Men både statiska och övergående hypoxi effekter på holme fysiologi har ännu inte förstått eller studerade, främst på grund av brist på lämpliga verktyg för att kontrollera holme s mikromiljö.
Holmar välvaskulariserade in vivo
Pankreasöar är 50-400 56, m sfäriska aggregat av endokrina celler, inklusive betaceller och alfaceller som är ansvariga för glukoshomeostas. När cellöar exponeras för stimulerande glukos i blodet, upptag och glykolys ledningen till ATP-produktion, vilket öppnar upp ATP-känsliga kalium (KATP) kanaler och resulterar i kalciuminflöde som utlöser exocytos av insulin granuler. Syre är viktigt för att driva detta hårt ämnesomsättning och insulinutsöndring är avsevärt påverkad av dynamiken i blodflödet och syretillförseln förutom glukos gradienter. Holmar utföra lätt denna glukos-insulinsvar in vivo eftersom de är mycket perfusion i bukspottkörteln, var och en inom en cell längd från en kapillär fartyg. Dock är det tätt nät av intraislet kapillärer bort av kollagenas under holme isolering 2,3. Följaktligen är både syre och näringsämnen leveranser begränsas till en 100 ìm omkrets på grund av diffusion begränsningar.
steg "> Aktuella tekniker har begränsad framgång i att återskapa holme mikromiljöÅter holme infödda syre-och glukosdynamik, nyckeln till modellering fysiologiska och patofysiologiska förhållanden, är svårt att uppnå med standard hypoxiska kammare som kräver genomarbetade flöde och saknar kontinuerlig övervakning av ö-funktioner. Dessutom transplantationsterapier för typ I-diabetes utsätta isolerade öar till hypoxi i leverportalsystem 4, som har mycket lägre pO 2 (<2%, 5-15 mm Hg) jämfört med fysiologisk bukspottkörteln (5,6%, 40 mm Hg). Efter transplantationen, öarna transplantat ta två veckor eller mer ska revascularized. Det har visat sig att hypoxisk exponering försämrar islet glukos-insulin-kopplingsmekanism. Bland de stimulus-sekrekopplingsfaktorer, kalcium signalering, mitokondriella potentialer och insulin kinetik kan enkelt kontrolleras med hjälp av mikrofluidik. Vår tidigare mikroflödesteknik visade denna real-tid övervakning med exakt modulering av den vattenbaserade mikromiljö runt enda holme 5,6. Dock är kvantifiering av holmen är hypoxisk försämring brottats med bristen på samtidiga stimulans-och övervakningsteknik. Därför kan kombinera mikroflödeskontroll av syre och holme övervakning förbättra holme hypoxi studier.
Mikrofluidik kan återskapa och modulera den vattenbaserade och syre mikromiljö
Den standardteknik på mjuk-och kultur hypoxi studier har baserats på hypoxiska kammare. I allmänhet är de hypoxiska kamrarna ger enkla syrehalter med ekvilibreringstider i ~ 10-30 min, oförenliga med minut-skalas dynamisk hypoxi. Två nya studier använde små anpassade kammare för intermittent hypoxi exponering på hela möss, med motstridiga resultat på glukos-inducerad insulinsvaret 7,8. Tänk på att i hela djurnivån, är det respireras syret inte direkt trantänkt att holme kapillär PO2, på grund av kontrollerna i andningsorganen. Dessutom har dessa studier inte har standardiserade syrenivåer, och inte heller ge realtid åtgärder på vävnadsnivå holmar.
Å andra sidan kan syre mikrofluidik träffa dessa begränsningar genom att reglera syre via gas-kanalnätverk. Dessutom är mikrofluidik kompatibel med levande avbildning under syremodulering, en bedrift för tillfället inte möjligt med vanliga hypoxiska kammare. Ett antal av dessa nya mikrofluidik närmar utnyttja gas permeabilitet polydimetylsiloxan att lösa syrehalter i mikrokanaler som strömmar media över målceller 9-14. Dessa enheter har också integrerat flera diskreta syrehalter, fluorescensbaserade syresensorer, samt även kemisk syregenerering på chip.
Vätskekristallbaserade mikrofluidik har svårt att bibehålla stabila, kontinuerliga gradienter som jagt är beroende av konvektiv blandning, som är känslig för flödesförhållandena. I jämförelse, den teknik som vi använder här är inriktad på att minska diffusion path of syreavgivning. Gasen solvatisering och skjuvflöde elimineras genom direkt diffunderar syre över ett membran besås med celler eller holme vävnader. Detta tar bort de extra mikrofluidik som krävs för att styra solvatisering och förhindrar onödig skjuvspänning till holmarna, som i sig kan utlösa insulinfrisättning. Denna plattform har använts för att visa att reaktiva syreradikaler (ROS) uppreglering både hyperoxic och hypoxiska ytterligheter (2-97% O 2) i cellkultur 1,15. På grund av den direkta leveransen av syre och avlägsnande av skjuvning flöde, ger vår diffusion-baserad plattform den optimala mikroflödes lösningen för att studera holme hypoxi.
Multimodal stimulans och övervakning
Diffusion-baserade mikroflödes innebär också ytterligare fördelar när anpassad för att studera holme milcrophysiology. Genom att använda ett membran som en diffusionsbarriär kan vätskan vara isolerad från de syre modulationer, vilket möjliggör kontroll av vattenhaltiga glukos stimuleringar oberoende av hypoxiska stimuleringar. Detta skapar en sandwichliknande samtidig stimulering som rumsligt pin-points leverans till holmarna. Dessutom, eftersom gasen är tidsmässigt moduleras via datorise microinjectors, kan vi modulera syrekoncentrationen 21-0% digitalt med övergående tid mindre än 60 sek. De dynamiska kontroller av syre och glukos mikromiljö vid mikroskopet tillåter en realtid multimodal protokoll som inte skulle vara möjligt eller utomordentligt besvärlig med vanliga hypoxiska kammare. Med hjälp av denna enhet, var kalciumsignalering (Fura-AM), mitokondriella potentialer (Rhodamine 123), och insulin kinetik (ELISA) övervakas för att ge en fullständig bild av den dynamiska glukos-insulin svar under hypoxi.
Protocol
Representative Results
Discussion
De olika formerna integrerade i denna holme hypoxi teknik presentera flera punkter noteras här för felsökning. Först de isolerade öarna fortsätter att brytas ned och upplösas i kultur på grund av matsmältningsenzymer från körtelceller. Standardisera försök till 1-2 dagar efter holme isolering är alltså avgörande för att få konsekventa resultat. För det andra, det vattenhaltiga flödet stoppas under hypoxi och intermittent hypoxi för att förhindra konvektiv clearance vid gränsen mellan laminärt fl?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 DK091526 (JO), NSF 0.852.416 (DTE), och Chicago Diabetes Project.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
Referências
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP – Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
