Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol
Summary
Mikroakışkan oksijen kontrol biyolojik deneyler için hipoksik odaları üzerinde sadece kolaylık ve hız daha fazla bahşeder. Bir zarından difüzyon yoluyla uygulanan, özellikle mikrofluidik oksijen mikro-düzeyde eşzamanlı sıvı ve gaz fazı modülasyon sağlayabilir. Bu teknik, adacık patofizyolojisi çalışmak için dinamik çok kritik parametre deneyler sağlar.
Abstract
Tek bir teknik glikoz uyarıcı salgılama birleştirme faktörler aynı anda oksijen ve izlenmesi özellikle transplant ortamlarda, adacık hipoksi fizyopatolojik durumlarını modellemek için çok önemlidir. Standart hipoksik odası teknikler aynı anda hem uyarılmalara modüle ne glikoz uyarı-sekresyon bağlama faktörlerin gerçek zamanlı izleme sağlayamaz. Bu zorlukları gidermek için, bir difüzyon membranı aracılığı ile sulu ve gaz fazı modülasyon hem de entegre bir katmanlı mikroakışkan tekniği uygulandı. Bu floresan mikroskobu ile yukarıda belirtilen birleştirme faktörlerin izlenmesi sağlayan saydam polidimetilsiloksan (PDMS) cihazı içinde microscaled adacık etrafında bir uyarım sandviç oluşturur. Buna ek olarak, gaz giriş% 0-21 arasındaki oksijen kantitatif, alt dakika modülasyonu sağlayan microdispensers bir çifti tarafından kontrol edilir. Bu aralıklı hipoksi ada yeni bir fenomen araştırmak için uygulanırt önşartlandırma. Ayrıca, multimodal mikroskobu ile donanmış, bu hipoksik olaylar sırasında ayrıntılı kalsiyum ve K ATP kanal dinamiklerine bakmak başardık. Biz adacıklar okuyan yanı sıra birçok ex vivo dokular değerli bir araç olarak, mikroakışkan hipoksi, özellikle bu eş zamanlı çift faz tekniği öngörülüyor.
Introduction
Dinamik hipoksi özellikle adacık nakli için, biyolojide önemli
Dinamik Hipoksi çok biyolojik dokuda önemli bir fizyolojik hem de patofizyolojik bir parametredir. Oksijen değişim, örneğin, anjiyojenezin güçlü bir gelişim sinyaldir. Ayrıca, hipoksi mekansal ve zamansal desenler HIF1-alfa modüle ve pankreas kanseri gibi hastalıklarda rol oynar. Hipoksi aynı zamanda adacık nakli sonuçlarını etkileyen karıştırıcı bir faktör olduğunu. Son zamanlarda, hipoksi veya aralıklı hipoksi (İH) zamansal olarak salınımları "önşartlama" adacık 1 faydalar göstermiştir. Ancak, adacık fizyoloji statik ve geçici hem hipoksi etkisi de öncelikle nedeniyle islet en mikroçevreyi kontrol etmek için uygun araçlar eksikliği anlaşılan ya, incelenecek henüz.
Islets iyi in vivo vaskülarize edilir
Pankreas adacıkları olan 50-400 56, beta-hücreleri ve glukoz homeostazı sorumlu olan alfa-hücreleri de dahil olmak üzere endokrin hücreleri, m küremsi agrega. Adacıklar ATP'ye duyarlı potasyum (K ATP) kanal ve insülin granül eksositosizini tetikler kalsiyum girişine sonuçlar açılır ATP üretimi için kan alımı ve glikoliz kurşun uyarıcı glikoz maruz kalır. Oksijen, bu ağır metabolik süreci götürmek ve insülin salgısı belirgin glukoz geçişlerini ek olarak kan akımı ve oksijen kaynağı dinamikleri tarafından etkilenir önemlidir. Bunlar son derece her biri, pankreas perfüze edildiği gibidir Islets kolayca kılcal bir tekneden bir hücre uzunluğu içinde in vivo olarak bu glukoz, insülin yanıtı gerçekleştirin. Bununla birlikte, adacık içi bir kapiller yoğun ağ doku adacığı izolasyonu 2,3 sırasında kolajenaz ile çıkarılır. Sonuç olarak, oksijen ve besin hem malzemeleri nedeniyle difüzyon sınırlamaları 100 mikron çevresine kısıtlı.
adacık mikroortam yeniden adım "> Güncel teknikler sınırlı başarıYeniden islet yerli oksijen ve glikoz dinamikleri, fizyolojik ve patofizyolojik koşulları modelleme anahtar, ayrıntılı akışını gerektiren ve adacık fonksiyonlarının sürekli izlenmesi eksikliği standart hipoksik odaları ile elde etmek zordur. Ayrıca, Tip nakli tedavileri ben diyabet pankreas fizyolojik (% 5.6, 40 mmHg) kıyasla çok daha düşük pO 2 (<% 2, 5-15 mmHg) olan hepatik portal sistem 4 hipoksi izole adacıklar maruz. Post-transplant, adacık greft Revaskülarize gereken iki hafta veya daha fazla sürebilir. Bu hipoksik maruz islet glikoz insülin bağlama mekanizmasını olumsuz etkileri gösterilmiştir. Uyarı-sekresyon bağlama faktörler, kalsiyum sinyalizasyon, mitokondriyal potansiyelleri, ve insülin kinetik arasında kolayca mikroflüidik kullanılarak izlenebilir olabilir. Bizim önceki microfluidic tekniği bu yeniden gösterdiEl-zamanlı tek adacık 5,6 civarında sulu mikro hassas modülasyonu ile izlenmesi. Ancak, adacık hipoksik bozulma ölçümü aynı anda uyarılması ve izleme teknikleri eksikliği stymied edilir. Bu nedenle, oksijen ve adacık izleme mikrofluidik kontrol birleştirerek adacık hipoksi çalışmaları artırabilir.
Mikroakiskan sulu ve oksijen mikroortam yeniden ve modüle edebilir
Doku ve kültürü hipoksi çalışmaları için standart teknik hipoksik odaları dayalı olmuştur. Genel olarak, hipoksik odaları dakika-ölçekli dinamik hipoksi ile bağdaşmayan ~ 10-30 dakika içinde dengeleme süreleri, tek oksijen konsantrasyonu sağlamak. İki yeni çalışmalar glikoz uyarılan insülin yanıtı 7,8 çelişkili sonuçlar, bütün fareler üzerinde aralıklı hipoksi poz için küçük özel odaları kullanılmaktadır. Bütün hayvan düzeyinde, solunuma oksijen doğrudan tran olmadığını Unutmayınnedeniyle solunum sistemi denetimleri, pO2 kılcal adacık planlanıyor. Dahası, bu çalışmalar, standart oksijen seviyeleri yoktur, ne de adacıklar doku düzeyinde gerçek-zamanlı önlemleri sağlıyoruz.
Öte yandan, oksijen Mikroakiskan gaz kanalı ağlar aracılığıyla oksijenin bu sınırlamaları aşmak olabilir. Ayrıca, Mikroakiskan, oksijen modülasyonu esnasında standart hipoksik odaları ile feat şu anda mümkün değil canlı görüntüleme ile uyumludur. Bu yeni Mikroakiskan bir dizi hedef hücrelerin 9-14 üzerinden medya akışı mikrokanallardaki içine oksijen konsantrasyonlarını çözmek için polidimetilsiloksanın gaz geçirgenliğini kullanmak yaklaşır. Bu cihazlar aynı zamanda birden fazla ayrık oksijen konsantrasyonlarını, floresan bazlı oksijen sensörleri, ve on-chip bile kimyasal oksijen nesil entegre etmiş.
Sıvı solvasyon tabanlı Mikroakiskan i gibi bir sabit zaman kararlı, sürekli geçişlerini bakımı vart koşulları akış duyarlıdır konvektif karıştırma bağlıdır. Buna karşılık, biz burada kullanmak teknik oksijen teslim difüzyon yolu azalan odaklanır. Gaz solvasyon makaslama akış doğrudan hücreler veya adacığı dokularla tohumlanmış bir zarından oksijen yayarak netleştirilmiştir. Bu solvasyonu kontrol etmek için gerekli ekstra mikroflüidik kaldırır ve kendisi insülin salınımını tetikleyebilir adacıklar, gereksiz kayma stresi önler. Bu platform reaktif oksijen türleri (ROS) göstermek için kullanılır olmuştur up-regülasyonu hücre kültürü 1,15 olarak hiperoksik ve hipoksik hem aşırı (2-97% O 2) de. Çünkü oksijen ve kesme akışının çıkarılması doğrudan teslimat, bizim difüzyon tabanlı platform adacık hipoksi çalışmaları için uygun mikroakışkan bir çözüm sağlar.
Multimodal stimülasyon ve izleme
Adacık MI çalışmak için adapte edilmiş zaman difüzyon merkezli ve arayüz da ek avantajlar getirircrophysiology. Bir difüzyon bariyeri olarak bir membran kullanılarak, sıvı hipoksik stimülasyondan bağımsız bir şekilde, sulu glukoz uyarılarının kontrol sağlayan, oksijen modülasyon izole edilebilir. Bu adacıklar mekansal pin puan teslimat sandviç gibi eşzamanlı stimülasyon oluşturur. Gaz geçici olarak bilgisayar mikropüskürtücü ile modüle edilir Dahası, biz 60 sn'den daha azdır, geçici bir süre ile dijital olarak 21-0 'den% oksijen konsantrasyonunu modüle edebilir. Mikroskop de oksijen ve glükoz mikro dinamik kontrol standart hipoksik odası kullanılarak mümkün ya da olağanüstü hantal değil, gerçek zamanlı bir protokolü multimodal izin verir. Bu cihazı kullanırken, kalsiyum sinyal (Fura-AM), mitokondriyal potansiyeller (Rhodamine 123) ve insülin kinetik (ELISA) hipoksi altında dinamik glikoz-insülin yanıtı tam bir resmini elde etmek için takip edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu adacık hipoksi tekniğin entegre çoklu yöntemler mevcut birkaç puan sorun giderme için burayı kaydetti. İlk izole adacıklar aşağılamak nedeniyle asiner hücrelerden sindirim enzimleri kültür çözülmeye devam ediyor. Doku adacığı izolasyonu sonra 1-2 gün için deneyler standartlaştırılması tutarlı sonuçlar elde etmek, böylece önemlidir. İkincisi, sulu akış laminer akışı ve difüzyon arasındaki sınırda konvektif boşluğunu önlemek için hipoksi ve aralıklı hipoksi sırasında dur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık Hibeler R01 DK091526 (JO), NSF 0.852.416 (DTE) Ulusal Enstitüleri, ve Chicago Diyabet Projesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
Referências
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP – Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
