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Imunologia e Infecção

Alimentazione di zecche su animali per trasmissione e Xenodiagnosis a Lyme Disease Research

Published: August 31, 2013
doi:
10.3791/50617
, , ,
1Division of Bacteriology & Parasitology, Tulane National Primate Research Center,Tulane University Health Sciences Center

Summary

La malattia di Lyme è la più comunemente riportati vector-borne malattia in Nord America. L'agente eziologico, Borrelia burgdorferi è un batterio spirocheta trasmessa da zecche ixodid. Trasmissione e rilevamento di un'infezione in modelli animali è ottimizzata dall'utilizzo di alimentazione tick, che descriveremo qui.

Abstract

La trasmissione dell'agente eziologico della malattia di Lyme, Borrelia burgdorferi, avviene l'attacco e l'alimentazione del sangue di specie Ixodes zecche su host mammiferi. In natura, questo patogeno batterico zoonotici possono utilizzare una varietà di host di giacimento, ma il topo bianco-footed (Peromyscus leucopus) è il serbatoio principale per le zecche larvali e ninfali in Nord America. Gli esseri umani sono padroni incidentali più frequentemente infettati da B. burgdorferi dal morso di zecche in fase di ninfa. B. burgdorferi adatta ai suoi ospiti durante tutto il ciclo di leucosi, quindi la capacità di esplorare le funzioni di queste spirochete e dei loro effetti sui ospiti mammiferi richiede l'uso di alimentazione tick. Inoltre, la tecnica di Xenodiagnosis (utilizzando il vettore naturale per il rilevamento e il recupero di un agente infettivo) è utile in studi di infezione criptica. Per ottenere nymphal zecche che porto B. burgdorferi,zecche sono alimentati spirochete vivi in ​​cultura attraverso tubi capillari. Due modelli animali, topi e primati non umani, sono più comunemente utilizzati per gli studi di malattia di Lyme che coinvolgono alimentazione tick. Dimostriamo le modalità con cui queste zecche possono essere alimentati al momento, e recuperato dagli animali sia per infezione o Xenodiagnosis.

Introduction

Nel 2011, la malattia di Lyme è stato il sesto più comune malattia a livello nazionale Notifiable in Nord America ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi è un microbo versatile, sia geneticamente e antigenicamente (rivisto in 1). La sua costituzione genetica comprende una grande (> 900 kB) cromosoma e fino a 21 plasmidi (12 lineari, circolari 9), con contenuto plasmide variabile tra gli isolati. Molto può essere imparato su questi spirochete, superiore al 90% del plasmide open reading frames estranei a qualsiasi sequenze batteriche conosciuti 2,3. B. burgdorferi presenta una grande varietà di antigeni come potenziali bersagli di immunità dell'ospite. Tuttavia, un'infezione non trattata spesso persiste. L'interazione del spirochete con l'ambiente tick e l'ambiente ospite vertebrato richiede adattamenti in B. burgdorferi tutto il processo di infezione. Diversi plasmidicageni sono noti per essere differenzialmente espressi in risposta alle variazioni di temperatura, pH, densità cellulare e persino fase del ciclo di vita tick 4-8.

Lo studio di B. adattamento burgdorferi tutto il suo ciclo leucosi e risposta dell'ospite dopo l'infezione per via naturale si basa sulla capacità di alimentare zecche su modelli animali appropriati. Tali studi sono soddisfatti con le sfide tecniche di generazione di zecche che ospitano B. burgdorferi, e garantire la trasmissione efficiente e / o l'alimentazione delle zecche sul modello di accoglienza. Inoltre, il contenimento e il recupero di zecche infette è essenziale. Tra i modelli utilizzati sono topi e primati non umani, ognuno dei quali funge da strumento prezioso nella ricerca sulla malattia di Lyme. Come con il mouse zampe bianche, che è un host serbatoio naturale per B. burgdorferi, il topo di laboratorio è un host altamente sensibile che supporta l'infezione persistente da parte di B. burgdorferi 9. Folsivo infezione di topi suscettibili alla malattia, come il ceppo C3H, le spirochete diffondere a più tessuti, compresa la pelle, della vescica, i muscoli, le articolazioni e il cuore. Risposte infiammatorie alle infezioni portano a cuore malato e tessuti articolari. Mentre le spirochete persistono in questa struttura e rimangono contagiosi, lesioni infiammatorie possono diventare intermittente, non diversamente dal processo negli esseri umani. Il modello di topo ha quindi fornito molte informazioni su B. burgdorferi patologia indotta, tra cui l'artrite e cardite e ospitare le risposte immunitarie 10-12. Dal punto di vista del patogeno, alcuni geni differenzialmente espressi durante l'infezione mammiferi sono stati caratterizzati, come avere qualche necessaria per la trasmissione della zecca vettore 13-21.

Sebbene diverse specie animali sono stati utilizzati per studiare la malattia di Lyme 22, macachi rhesus più strettamente imitare il carattere multi-organo di malattia umana 23. A differenza di altrimodelli animali, l'ampiezza delle manifestazioni della malattia, quali eritema migrans, cardite, artrite, e la neuropatia del sistema nervoso centrale e periferico sono osservate nei macachi. Nei topi, l'ospite serbatoio per B. burgdorferi, malattia varia da ceppo di topi e 24 anni, mentre le precoci e tardive diffuse manifestazioni sono infrequenti 9. Inoltre, altri roditori, lagomorfi, e canini tutti riescono a esporre malattia neurologica da B. burgdorferi 25. È importante sottolineare che, macachi mostrano segni che sono caratteristici di tutte e tre le fasi della borreliosi di Lyme, vale a dire, precoce localizzata, precoce disseminata e in fase avanzata della malattia di Lyme 26-28. L'eritema migrante (EM) è pensato per verificarsi nel 70-80% dei casi umani 29, e si vede anche nei macachi rhesus 28,30. Dopo l'infezione, le spirochete diffondere dal sito di inoculazione di organi multipli. DNA spirochetal è stato rilevato in mu scheletricoscles, cuore, vescica, dei nervi periferici e del plesso, nonché nel sistema nervoso centrale (cervello, cervelletto e tronco cerebrale, midollo spinale, e dura madre) 31.

Spunta nutrendosi di topi è stato utilizzato da noi e da altri gruppi di ricerca per la moltiplicazione delle colonie di zecche, in competenza serbatoio studia 32-36 e negli studi di B. burgdorferi patogenesi 37-40. Questa tecnica è stata utilizzata anche per Xenodiagnosis e test di efficacia del vaccino nei topi 41-44. Abbiamo nutrito zecche Ixodes su primati non umani per il modello di sviluppo 28, uno studio di efficacia del vaccino 45, e per Xenodiagnosis nella valutazione della persistenza trattamento post-antibiotico 46. Le zecche che porto B. burgdorferi può essere mantenuta in un ciclo leucosi naturale nutrendosi di larve sui topi infetti e con le ninfe per gli studi, le spirochete sono trasmessi attraverso le fasi della vita. In questo rapporto, Ci spiegherà come generare zecche infettate con wild type o mutante B. burgdorferi, utilizzando capillare tubo di alimentazione. Questo può anche essere realizzato mediante microiniezione 47 e 48 per immersione. Lo scopo della introduzione artificiale di B. burgdorferi nelle zecche possono essere di studiare ceppi mutanti la cui trasmissibilità è sconosciuto, per generare un gruppo di zecche, con un alto tasso di infezione, e per ridurre il rischio di errore mantenendo un segno di spunta colonia pulito e altrimenti non infetto. Inoltre, dimostriamo alimentazione segno di spunta su topi e primati non umani, in modo da assicurare il contenimento e il recupero delle zecche piene. L'uso di alimentazione tick è essenziale per gli studi futuri di risposte immunitarie a B. burgdorferi, potenziale efficacia del vaccino di Lyme, e Xenodiagnosis a rilevare le infezioni occulte.

Protocol

Uno schema sperimentale di zecca inoculazione e di alimentazione su animali per la ricerca della malattia di Lyme è illustrato in Figura 1. 1. Inoculando nymphal zecche Ixodes con B. burgdorferi Uso capillare Tube-alimentazione Quando si esegue manipolazioni con le zecche, camice bianco con maniche elastici, guanti e cappellini bouffant usa e getta sono usurati. La nostra tecnica è una versione modificata di quella …

Representative Results

A seguito del completamento di alimentazione capillare, le zecche sono tipicamente riposato a 23 ° C per 2-3 settimane prima di essere alimentati su animali per la trasmissione. Utilizzando la tecnica capillare al seno, abbiamo scoperto che oltre il 90% della Fed zecche porto B. burgdorferi. La percentuale di zecche positive viene determinata mediante lavaggio zecche in perossido ed etanolo, poi schiacciandoli in PBS sterile con un pestello a forma di provetta per microcentrifuga. Il contenuto dell'intesti…

Discussion

Al fine di ottenere le zecche che porto B. burgdorferi per studi a valle, le zecche possono essere: (1) alimentati con topi infettati allo stadio larvale, (2) immerso in B. culture burgdorferi alle due larvale o ninfale fase 48; (3) microiniettati con B. burgdorferi 47; o (4) capillare tubo-fed B. burgdorferi 49. Mentre ciascuno di questi metodi ha il suo scopo, per assicurare che una gran parte delle zecche da utilizzare per porto infezione <…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Nicole Hasenkampf e Amanda Tardo per il supporto tecnico. Ringraziamo anche Drs. Linden Hu e Adriana Marques per raccomandazione del dispositivo di contenimento LeFlap, ed il Dott. Lise Gern per istruzioni sul metodo di alimentazione capillare. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NCRR di Grant 8 P20 GM103458-09 (MEE) e dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca e l'Ufficio Programmi di infrastrutture di ricerca (ORIP) dei National Institutes of Health attraverso la concessione P51OD011104/P51RR000164.

Materials

Reagent
BSK-H Sigma B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste Ladd research T-131
SkinPrep Allegro Medical Supplies 177364
LeFlap, 3″ x 3″ Monarch Labs
Hypafix tape Allegro Medical Supplies 191523
SkinBond Allegro Medical Supplies 554536
UniSolve Allegro Medical Supplies 176640
Biatane Foam, adhesive 4″x4″ Coloplast 3420
DuoDerm CGF Dressing – 4″ x 4″, (3/4)” adhesive border Convatec 187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2″ back panels; add drawstrings at top and bottom Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller David Kopf Instruments Model 700C
Dark field microscope Leitz Wetzlar Dialux
Dissecting microscope Leica Zoom 2000
Mouse caging Allentown caging
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Embers, M. E., Grasperge, B. J., Jacobs, M. B., Philipp, M. T. Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research. J. Vis. Exp. (78), e50617, doi:10.3791/50617 (2013).
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