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Imunologia e Infecção

La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

Published: August 31, 2013
doi:
10.3791/50617
, , ,
1Division of Bacteriology & Parasitology, Tulane National Primate Research Center,Tulane University Health Sciences Center

Summary

La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vectores más comúnmente reportados en América del Norte. El agente causante, Borrelia burgdorferi es una bacteria espiroqueta transmitida por garrapatas ixódidas. Transmisión y detección de la infección en modelos animales se optimiza mediante el uso de la alimentación de la señal, que se describe aquí.

Abstract

La transmisión del agente etiológico de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi, se produce por la unión y la alimentación de la sangre de la especie Ixodes garrapatas en huéspedes mamíferos. En la naturaleza, este patógeno bacteriano zoonótico puede utilizar una variedad de reservorios, pero el ratón de patas blancas (Peromyscus leucopus) es el principal reservorio de larvas de garrapatas y de ninfas en América del Norte. Los seres humanos son huéspedes accidentales más frecuentemente infectados con B. burgdorferi por la picadura de garrapatas en la etapa de ninfa. B. burgdorferi se adapta a sus anfitriones durante todo el ciclo enzoótica, por lo que la capacidad de explorar las funciones de estas espiroquetas y sus efectos en huéspedes mamíferos requiere el uso de la alimentación de la garrapata. Además, la técnica de xenodiagnóstico (utilizando el vector natural para la detección y la recuperación de un agente infeccioso) ha sido útil en los estudios de la infección críptica. Con el fin de obtener de ninfa garrapatas que puerto B. burgdorferi,garrapatas se alimentan espiroquetas vivas en la cultura a través de tubos capilares. Dos modelos animales, ratones y primates no humanos, son los más utilizados para los estudios de la enfermedad de Lyme que involucran la alimentación de la garrapata. Demostramos los métodos por los cuales estas garrapatas pueden ser alimentados en, y se recuperaron de los animales, ya sea para una infección o xenodiagnóstico.

Introduction

En 2011, la enfermedad de Lyme es la sexta enfermedad de declaración obligatoria a nivel nacional más común en América del Norte ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi es un microbio versátil, tanto genética y antigénicamente (revisado en 1). Su constitución genética incluye un grande (> 900 kB) cromosoma y hasta 21 plásmidos (12 lineales, circulares 9), con un contenido variable plásmido entre los aislados. Hay mucho que aprender acerca de esta espiroqueta, ya que más del 90% de los marcos de lectura abierta de plásmidos no están relacionados con ninguna de las secuencias bacterianas conocidas 2,3. B. burgdorferi presenta una amplia variedad de antígenos como posibles objetivos de la inmunidad del huésped. Sin embargo, una infección no tratada a menudo persiste. La interacción de las espiroquetas con el medio de la garrapata y el medio ambiente hospedador vertebrado exige una adaptación de B. burgdorferi en todo el proceso de infección. Codificada-plásmido Varioslos genes son conocidos por ser expresadas diferencialmente en respuesta a cambios en la temperatura, el pH, la densidad celular e incluso etapa del ciclo de vida de garrapata 4-8.

El estudio de B. adaptación burgdorferi lo largo de su ciclo de enzoótica, y las respuestas del huésped después de la infección por la ruta natural se basa en la capacidad de alimentar las garrapatas en modelos animales apropiados. Este tipo de estudios se reunieron con los retos técnicos de la generación de garrapatas que albergan B. burgdorferi, y garantizar el transporte y / o alimentación eficiente de garrapatas en el modelo de acogida. Además, la contención y la recuperación de las garrapatas infectadas es esencial. Entre los modelos utilizados son ratones y primates no humanos, cada uno de los cuales sirve como una herramienta valiosa en la investigación de la enfermedad de Lyme. Al igual que con el ratón de patas blancas, que es un huésped reservorio natural para B. burgdorferi, el ratón de laboratorio es un anfitrión muy susceptibles que apoya la infección persistente por parte B. burgdorferi 9. FolLowing infección de ratones susceptibles de enfermedades, como la cepa C3H, las espiroquetas difunden a varios tejidos, incluyendo la piel, la vejiga, los músculos, las articulaciones y el corazón. Las respuestas inflamatorias a la infección conducen al corazón enfermo y el tejido articular. Mientras que las espiroquetas persisten en este host y siguen siendo infecciosas, lesiones inflamatorias pueden llegar a ser intermitente, no muy diferente del proceso en los seres humanos. Así pues, el modelo de ratón ha proporcionado mucha información sobre B. la patología inducida por burgdorferi, incluyendo la artritis y la carditis y respuestas inmunes del huésped 10-12. Desde la perspectiva del patógeno, ciertos genes expresados ​​diferencialmente durante la infección de mamíferos se han caracterizado, como tener algún necesario para la transmisión a partir del vector garrapata 13-21.

Aunque varias especies de animales se han utilizado para estudiar la enfermedad de Lyme 22, macacos rhesus imitan más de cerca el carácter multi-órgano de la enfermedad humana 23. A diferencia de otrosmodelos animales, la amplitud de manifestaciones de la enfermedad tales como eritema migratorio, la carditis, la artritis, la neuropatía y de los sistemas nerviosos periférico y central se observaron en macacos. En ratones, el huésped reservorio de B. burgdorferi, la enfermedad varía según la cepa de ratón y los 24 años, mientras que las manifestaciones tempranas y tardías diseminada son infrecuentes 9. Además, otros roedores, lagomorfos, y caninos todos fallan en exhibir enfermedad neurológica de B. burgdorferi infección 25. Es importante destacar que los macacos muestran signos característicos de las tres fases de la borreliosis de Lyme, a saber,,-diseminada temprana temprana localizada, y la enfermedad de Lyme en etapa tardía 26-28. Eritema migrans (EM) se cree que ocurre en el 70-80% de los casos en humanos 29, y también se observaron en macacos rhesus 28,30. Después de la infección, las espiroquetas difunden desde el sitio de la inoculación a múltiples órganos. ADN espiroquetas se ha detectado en MU esqueléticoscles, corazón, la vejiga, los nervios periféricos y del plexo, así como en el sistema nervioso central (cerebro, tronco cerebral y cerebelo, médula espinal, y duramadre) 31.

Marque alimentándose de ratones ha sido utilizada por nosotros y otros equipos de investigación para la propagación de las colonias de garrapatas, en competencia como reservorio estudia 32-36 y en los estudios de B. burgdorferi patogenia 37-40. Esta técnica también se ha utilizado para xenodiagnóstico y pruebas de eficacia de la vacuna en ratones 41-44. Hemos alimentado Ixodes garrapatas en primates no humanos para el desarrollo del modelo 28, un estudio de la eficacia de la vacuna de 45 años, y para el xenodiagnóstico en la evaluación de la persistencia del tratamiento post-antibiótico 46. Las garrapatas que puerto B. burgdorferi se puede mantener en un ciclo enzoótico naturales por la alimentación de las larvas en los ratones infectados y el uso de las ninfas de los estudios, como las espiroquetas se transmiten a través de las etapas de la vida. En este informe, Instruimos sobre cómo generar garrapatas infectadas con el tipo salvaje o mutante B. burgdorferi, con alimentación por tubo capilar. Esto también se puede lograr mediante microinyección 47 y por inmersión 48. El propósito de la introducción artificial de B. burgdorferi en las garrapatas pueden ser para estudiar cepas mutantes cuya transmisibilidad es desconocido, para generar un grupo de garrapatas con una alta tasa de infección, y para reducir el potencial de error mediante el mantenimiento de una colonia garrapata limpio y de lo contrario no infectada. Además, demostramos marcar la alimentación en ratones y primates no humanos, así como para asegurar la contención y recuperación de las garrapatas repletas. El uso de marcar la alimentación es esencial para futuros estudios de la respuesta inmune a B. burgdorferi infección, el potencial de eficacia de la vacuna de Lyme y xenodiagnóstico para la detección de infecciones ocultas.

Protocol

Un esquema experimental de la inoculación de la garrapata y la alimentación de los animales para la investigación La enfermedad de Lyme se representa en la figura 1. 1. Inocular ninfas Ixodes garrapatas con B. burgdorferi Uso Capilar-La alimentación por sonda Al realizar manipulaciones con las garrapatas, se usan batas blancas con mangas elásticas, guantes y gorras bouffant desechables. Nuestra técnica es una ve…

Representative Results

Tras la finalización de la alimentación capilar, las garrapatas son típicamente descansaban a 23 ° C durante 2-3 semanas antes de que se alimentan de animales para la transmisión. El uso de la técnica de alimentación capilar, se ha encontrado que más del 90% de la Fed garrapatas puerto B. burgdorferi. El porcentaje de las garrapatas positivas se determina mediante lavado garrapatas en peróxido y etanol, y luego aplastarlas en PBS estéril con una mano de mortero en forma de tubo de microcentrífuga. Lo…

Discussion

Con el fin de obtener las garrapatas que puerto B. burgdorferi para estudios posteriores, las garrapatas pueden ser: (1) que se nutre de los ratones infectados en la etapa larval, (2) sumergido en B. culturas burgdorferi, ya sea en la etapa de larva o ninfa; 48 (3) microinyectaron con B. burgdorferi 47; o (4) alimentado-tubo capilar B. burgdorferi 49. Aunque cada uno de estos métodos tiene su propósito, para asegurar que una gran porción de…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Nicole Hasenkampf y Amanda Tardo para soporte técnico. También queremos agradecer a los Dres. Linden Hu y Adriana Marques por recomendación del dispositivo de contención LeFlap, y el Dr. Lise Gern para obtener instrucciones sobre el método de alimentación capilar. Este trabajo fue apoyado por el NIH / CNRR Beca 8 P20 GM103458-09 (MEE) y por el Centro Nacional para Recursos de Investigación y la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación (ORIP) de los Institutos Nacionales de Salud a través de P51OD011104/P51RR000164 subvención.

Materials

Reagent
BSK-H Sigma B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste Ladd research T-131
SkinPrep Allegro Medical Supplies 177364
LeFlap, 3″ x 3″ Monarch Labs
Hypafix tape Allegro Medical Supplies 191523
SkinBond Allegro Medical Supplies 554536
UniSolve Allegro Medical Supplies 176640
Biatane Foam, adhesive 4″x4″ Coloplast 3420
DuoDerm CGF Dressing – 4″ x 4″, (3/4)” adhesive border Convatec 187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2″ back panels; add drawstrings at top and bottom Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller David Kopf Instruments Model 700C
Dark field microscope Leitz Wetzlar Dialux
Dissecting microscope Leica Zoom 2000
Mouse caging Allentown caging
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Referências

  1. Porcella, S. F., Schwan, T. G. Borrelia burgdorferi and Treponema pallidum: a comparison of functional genomics, environmental adaptations, and pathogenic mechanisms. Journal of Clinical Investigation. 107, 651-656 (2001).
  2. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390, 580-586 (1997).
  3. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: the twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35, 490-516 (2000).
  4. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection & Immunity. 67, 3181-3187 (1999).
  5. Gilmore, R. D., Mbow, M. L., Stevenson, B. Analysis of Borrelia burgdorferi gene expression during life cycle phases of the tick vector Ixodes scapularis. Microbes & Infection. 3, 799-808 (2001).
  6. Ramamoorthy, R., Philipp, M. T. Differential expression of Borrelia burgdorferi proteins during growth in vitro. Infection & Immunity. 66, 5119-5124 (1998).
  7. Ramamoorthy, R., Scholl-Meeker, D. Borrelia burgdorferi proteins whose expression is similarly affected by culture temperature and pH. Infection & Immunity. 69, 2739-2742 (2001).
  8. Schwan, T. G., Piesman, J. Temporal Changes in Outer Surface Proteins A and C of the Lyme Disease-Associated Spirochete, Borrelia burgdorferi, during the Chain of Infection in Ticks and Mice. J. Clin. Microbiol. 38, 382-388 (2000).
  9. Barthold, S. W., de Souza, M. S., Janotka, J. L., Smith, A. L., Persing, D. H. Chronic Lyme borreliosis in the laboratory mouse. Am. J. Pathol. 143, 959-971 (1993).
  10. Barthold, S. W., de Souza, M. Exacerbation of Lyme arthritis in beige mice. Journal of Infectious Diseases. 172, 778-784 (1995).
  11. Barthold, S. W., Feng, S., Bockenstedt, L. K., Fikrig, E., Feen, K. Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi. Clin. Infect. Dis. 25, S9-S17 (1997).
  12. Miller, J. C., Ma, Y., Crandall, H., Wang, X., Weis, J. J. Gene expression profiling provides insights into the pathways involved in inflammatory arthritis development: Murine model of Lyme disease. Experimental and Molecular Pathology. 85, 20-27 (2008).
  13. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13865-13870 (2000).
  14. Grimm, D., et al. Outer-surface protein C of the Lyme disease spirochete: a protein induced in ticks for infection of mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 3142-3147 (2004).
  15. Zhang, J. R., Norris, S. J. Kinetics and in vivo induction of genetic variation of vlsE in Borrelia burgdorferi. Infection & Immunity. 66 (1), 3689-3697 (1999).
  16. Hodzic, E., Feng, S., Freet, K. J., Borjesson, D. L., Barthold, S. W. Borrelia burgdorferi population kinetics and selected gene expression at the host-vector interface. Infection & Immunity. 70, 3382-3388 (2002).
  17. Hodzic, E., Feng, S., Freet, K. J., Barthold, S. W. Borrelia burgdorferi population dynamics and prototype gene expression during infection of immunocompetent and immunodeficient mice. Infection & Immunity. 71, 5042-5055 (2003).
  18. Liang, F. T., Nelson, F. K., Fikrig, E. Molecular adaptation of Borrelia burgdorferi in the murine host. Journal of Experimental Medicine. 196, 275-280 (2002).
  19. Samuels, D. S. Gene Regulation in Borrelia burgdorferi. Annual Review of Microbiology. 65, 479-499 (1146).
  20. Gilmore, R. D., et al. The bba64 gene of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent, is critical for mammalian infection via tick bite transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 7515-7520 (2010).
  21. Fisher, M. A., et al. Borrelia burgdorferi σ54 is required for mammalian infection and vector transmission but not for tick colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5162-5167 (2005).
  22. Barthold, S. W. Animal models for Lyme disease. Laboratory Investigation. 72, 127-130 (1995).
  23. Pachner, A. R. Early disseminated Lyme disease: Lyme meningitis. American Journal of Medicine. 98, 30S-37S (1995).
  24. Barthold, S. W., Beck, D. S., Hansen, G. M., Terwilliger, G. A., Moody, K. D. Lyme Borreliosis in Selected Strains and Ages of Laboratory Mice. Journal of Infectious Diseases. 162, 133-138 (1990).
  25. Philipp, M. T., Johnson, B. J. Animal models of Lyme disease: pathogenesis and immunoprophylaxis. Trends in Microbiology. 2, 431-437 (1994).
  26. Roberts, E. D., et al. Pathogenesis of Lyme neuroborreliosis in the rhesus monkey: the early disseminated and chronic phases of disease in the peripheral nervous system. Journal of Infectious Diseases. 178, 722-732 (1998).
  27. Roberts, E. D., et al. Chronic lyme disease in the rhesus monkey. Laboratory Investigation. 72, 146-160 (1995).
  28. Philipp, M. T., et al. Early and early disseminated phases of Lyme disease in the rhesus monkey: a model for infection in humans. Infection & Immunity. 61, 3047-3059 (1993).
  29. Steere, A. C., Sikand, V. K., 348, T. r. e. a. t. m. e. n. t. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .. M. e. d. .. The Presenting Manifestations of Lyme Disease and the Outcomes of Treatment. N. Engl. J. Med. 348, 2472-2474 (2003).
  30. Pachner, A. R., Delaney, E., O’Neill, T., Major, E. Inoculation of nonhuman primates with the N40 strain of Borrelia burgdorferi leads to a model of Lyme neuroborreliosis faithful to the human disease. Neurology. 45, 165-172 (1995).
  31. Cadavid, D., O’Neill, T., Schaefer, H., Pachner, A. R. Localization of Borrelia burgdorferi in the nervous system and other organs in a nonhuman primate model of lyme disease. Laboratory Investigation. 80, 1043-1054 (2000).
  32. Mather, T. N., Wilson, M. L., Moore, S. I., Ribiero, J. M. C., Spielman, A. Comparing the Relative Potential of Rodents as Reservoirs of the Lyme Disease Spirochete (Borrelia Burgdorferi).. American Journal of Epidemiology. 130, 143-150 (1989).
  33. Mather, T. N., Telford, S. R., Moore, S. I., Spielman, A. Borrelia burgdorferi and Babesia microti: Efficiency of transmission from reservoirs to vector ticks (Ixodes dammini). Experimental Parasitology. 70 (90), 55-61 (1990).
  34. Telford, S. R., Mather, T. N., Adler, G. H., Spielman, A. Short-tailed shrews as reservoirs of the agents of Lyme disease and human babesiosis. Journal of Parasitology. 76, 681-683 (1990).
  35. Mather, T. N., Fish, D., Coughlin, R. T. Competence of dogs as reservoirs for Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi). J. Am. Vet. Med. Assoc. 205, 186-188 (1994).
  36. Telford, S. R., Mather, T. N., Moore, S. I., Wilson, M. L., Spielman, A. Incompetence of deer as reservoirs of the Lyme disease spirochete. Am. J. Trop. Med. Hyg. 39, 105-109 (1988).
  37. Lin, T., et al. Analysis of an Ordered, Comprehensive STM Mutant Library in Infectious Borrelia burgdorferi: Insights into the Genes Required for Mouse Infectivity. PLoS ONE. 7, e47532 (2012).
  38. Lin, T., et al. Central Role of the Holliday Junction Helicase RuvAB in vlsE Recombination and Infectivity of Borrelia burgdorferi. PLoS Pathog. 5, e1000679 (2009).
  39. Jacobs, M. B., Norris, S. J., Phillippi-Falkenstein, K. M., Philipp, M. T. Infectivity of the Highly Transformable BBE02- lp56- Mutant of Borrelia burgdorferi, the Lyme Disease Spirochete, via Ticks. Infection and Immunity. 74, 3678-3681 (2006).
  40. Jacobs, M. B., Purcell, J. E., Philipp, M. T. Ixodes scapularis ticks (Acari: Ixodidae) from Louisiana are competent to transmit Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme borreliosis. J. Med. Entomol. 40, 964-967 (2003).
  41. Bockenstedt, L., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S., Fish, D. Detection of Attenuated, Noninfectious Spirochetes in Borrelia burgdorferi-Infected Mice after Antibiotic Treatment. The Journal of Infectious Diseases. 186, 1430-1437 (2002).
  42. Barthold, S. W., et al. Ineffectiveness of tigecycline against persistent Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 54, 643-651 (2010).
  43. de Silva, A. M., Telford, S. R., Brunet, L. R., Barthold, S. W., Fikrig, E. Borrelia burgdorferi OspA is an arthropod-specific transmission-blocking Lyme disease vaccine. Journal of Experimental Medicine. 183, 271-275 (1996).
  44. Fikrig, E., et al. Vaccination against Lyme disease caused by diverse Borrelia burgdorferi. Journal of Experimental Medicine. 181, 215-221 (1995).
  45. Philipp, M. T., et al. The outer surface protein A (OspA) vaccine against Lyme disease: efficacy in the rhesus monkey. Vaccine. 15, 1872-1887 (1997).
  46. Embers, M. E., et al. Persistence of Borrelia burgdorferi in Rhesus Macaques following Antibiotic Treatment of Disseminated Infection. PLoS ONE. 7, e29914 (2012).
  47. Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. , e2544 (2011).
  48. Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J. Med. Entomol. 40, 364-370 (2003).
  49. Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., de Silva, A. M. Glass Capillary Tube Feeding: A Method for Infecting Nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with The Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Medical Entomology. 39, 285-292 (2002).
  50. Hodzic, E., Feng, S., Holden, K., Freet, K. J., Barthold, S. W. Persistence of Borrelia burgdorferi following antibiotic treatment in mice. Antimicrob Agents Chemother. 52, 1728-1736 (2008).
  51. Bockenstedt, L. K., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S. W., Fish, D. Detection of attenuated, noninfectious spirochetes in Borrelia burgdorferi-infected mice after antibiotic treatment. Journal of Infectious Diseases. 186, 1430-1437 (2002).
  52. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56, 1831-1836 (1988).

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Embers, M. E., Grasperge, B. J., Jacobs, M. B., Philipp, M. T. Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research. J. Vis. Exp. (78), e50617, doi:10.3791/50617 (2013).
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