Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

Resumo

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Resumo

O sistema nervoso é frequentemente descrito como um componente de hard-wired do corpo, mesmo que seja um sistema de órgãos consideravelmente fluido que reage a estímulos externos em uma maneira consistente estereotipado, mantendo ao mesmo tempo a flexibilidade e plasticidade incrível. Ao contrário do sistema nervoso central (SNC), o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa, mas apenas começaram a compreender os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando zebrafish como um sistema modelo, temos a oportunidade sem precedentes para estudos regenerativos casal com in vivo de imagens e manipulação genética. Os nervos periféricos são compostos de axónios rodeado por camadas de células gliais e de tecido conjuntivo. Axônios são ensheathed por myelinating ou não células mielinizantes de Schwann, as quais são, por sua vez envolvida num fascículo por uma bainha celular chamado o perineuro. Após uma lesão, nervos periféricos adultos têm a notável capacidade de remove danificado detritos axonal e alvos de re-inervam. Para investigar os papéis de todos os glia periférica na regeneração PNS, descrevemos aqui um ensaio transection axônio que usa um laser de corante disponível comercialmente nitrogênio bombeado para axotomize nervos motores em zebrafish transgênicos ao vivo. Descrevemos ainda mais os métodos para casal estas experiências à imagem time-lapse de nervos lesados ​​e controle. Este paradigma experimental pode ser utilizado não só para avaliar o papel que desempenham na glia regeneração do nervo, mas pode também ser a plataforma para elucidar os mecanismos moleculares que governam a reparação do sistema nervoso.

Introdução

Zebrafish têm sido extensivamente usados ​​para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso devido a sua transparência óptica e facilidade de transgénese, que, quando acoplados, para permitir imagiologia espectacular dos comportamentos dinâmicos das células num embrião vivo. Além disso, por causa do peixe-zebra e mamíferos partes quase todos os genes necessários para a formação do sistema nervoso, a informação celular e molecular recolhidos neste modelo organismo é directamente relacionáveis ​​com outras espécies de vertebrados. Embora extremamente poderosa para o estudo do desenvolvimento neural, o peixe-zebra e os seus atributos únicos têm o potencial de também ex....

Protocolo

1. Preparação e montagem de embriões Zebrafish para ablação e Imagens ao vivo

1. Prepare um estoque de 0,8% de baixa fusão agarose em água ovo. Alíquotas 13X em tubos de cultura de 100 mm descartáveis ​​e armazenar a 4 ° C até ser necessário.
2. Zebrafish adulto Cruz contendo estavelmente transgenes integrados para rotular fluorescente os neurônios motores e tipos de interesse de células gliais. Coletar embriões zebrafish em água ovo e coloque em 28,5 ° C incubadora para o estadiamento correto mais tarde ^3.
3. Aproximadamente 24 horas após a fertilização (HPF), remover a água do ovo e adicionar 0,002% de 1-fenil 2-tioureia (PTU) em ág....

Resultados

O ensaio aqui descrito pode ser usado para avaliar a resposta das células da glia e outras populações de células nervosas associadas a lesão axonal in vivo. Filme 1 mostra um exemplo de uma lesão do nervo criada usando este método e a resposta de células vizinhas gliais. Este experimento foi realizado em Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (OLIG2: DsRed) zebrafish, no qual glia perineural expressar uma membrana alvo EGFP e neurônios motores expressa cytosolic DsRed. A lesão foi feito ao longo da p.......

Discussão

Os passos mais críticos da presente delineamento experimental são os seguintes: 1) para a montagem propriamente larvas lesão e subsequente in vivo de imagens e 2) calibrar o laser e escolhendo os ajustes de potência correctos, a fim de criar um corte transversal do nervo limpa que resulta em danos mínimos dos tecidos extra- . Para ajudar a garantir uma axotomia sucesso para in vivo de imagens e posterior análise, montar larvas múltiplas tanto em pratos com fundo de vidro individuais ou em um prato fund.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Feniltioureia	Sigma	P7629-100G
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
Baixo ponto de fusão agarose	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview Placas de Cultura de Células, Fundo de Vidro, Estéril, Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
Placas de Petri com fundo de vidro de poço único 35 x Sistema	a laser Willco Wells	GWSt-3512
com todos os componentes	da Andor Technology - adquirido através da Quorum Technologies, Inc.	2203-SYS
MicroPoint Laser Courmarin corante (435 nm)	Andor Technology	MP-27-435-DYE

de 10 mm de espessura