وضعت مختبرنا والإنتاجية العالية نظام التصوير الآلي رواية يمكن أن يكون مفيدا للكشف عن العديد من السلوكيات المختلفة في اليرقات الزرد لمدة 7 أيام من العمر. ويمكن استخدام النظام للكشف عن التغييرات الطفيفة في السلوك بعد أن يكونوا قد تعرضوا اليرقات إلى المواد السامة البيئية أو المستحضرات الصيدلانية.
قمنا بإنشاء نظام التصوير عالية الإنتاجية رواية لتحليل سلوك اليرقات في الزرد لمدة 7 أيام من العمر في لوحات متعددة الحارات. يقيس هذا النظام السلوكيات العفوية وردا على التحفيز مكره، والذي يظهر أن اليرقات عبر عرض تقديمي ل PowerPoint. يتم تحليل الصور المسجلة مع ماكرو يماغيج، الذي يقسم قنوات اللون تلقائيا، ينقص الخلفية، وينطبق عتبة لتحديد موضع اليرقات الفردية في الممرات. يمكننا بعد ذلك استيراد إحداثيات في ورقة اكسل لقياس سرعة السباحة، وتفضيل حافة أو جانب من الممر، ويستريح السلوك، انجذاب بالتماس، وبعد المسافة بين اليرقات، وسلوك التهرب. التغييرات الطفيفة في السلوك يتم بسهولة الكشف عن استخدام النظام لدينا، مما يجعلها مفيدة للتحليلات سلوكية بعد التعرض للسميات البيئية أو المستحضرات الصيدلانية.
الزرد أصبحت نموذجا محببا للعلوم الوراثية التنموية والسلوكية، 1-4. تفقس من chorions من خلال 2-3 أيام آخر الإخصاب (DPF)، وتطوير الأجهزة تعمل بشكل كامل من قبل 4-5 DPF، ويحمل عدد كبير من السلوكيات بنسبة 7 DPF 5،6. هي مناسبة بشكل مثالي ليرقات اسماك الزرد التحليلات عالية الإنتاجية بسبب صغر حجم 7،8. البرنامج متاح تجاريا لتحليل الآلي للسلوك في اليرقات والكبار الزرد 9-14. ومع ذلك، يمكن لهذا البرنامج أن تكون مكلفة ولها خيارات محدودة لقياس السلوكيات المعقدة من اليرقات الزرد في لوحات متعددة جيدا.
أنشأنا نظام التصوير عالية الإنتاجية الرواية التي هي غير مكلفة لإعداد ويمكن تحديد عدد من السلوكيات المختلفة في 7 DPF الزرد اليرقات 15،16. النظام يسمح لنا بسرعة وكفاءة لاختبار الانحرافات السلوكية خفية بعد التعرض الجنينية إلى عدد منالمستحضرات الصيدلانية والمواد السامة البيئية 16-18.
تم بناء النظام باستخدام خزائن خشبية، والتي منزل كاميرا رقمية في الجزء العلوي من مجلس الوزراء. الكاميرا تواجه الهبوط إلى أسفل لمجلس الوزراء حيث يتم وضع جهاز كمبيوتر محمول مع شاشة مواجهة 15. ويستخدم الوقت الفاصل بين التصوير لالتقاط وضع اليرقات في الممرات. يمكن أن يضم اليرقات في ما يصل إلى أربعة لوحات متعددة جيدا أو متعددة الحارات التي تتمركز على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. نحن نستخدم عرض تقديمي ل PowerPoint لأنها تشكل حافزا مكره التي اليرقات الرد عن طريق تحريك بعيدا (تجنب) والسباحة نحو الحافة (انجذاب بالتماس) 15،17. يتم استيراد الصور في يماغيج التي يستخدم ماكرو الآلي لتقسيم قنوات اللون، طرح الخلفية، وتطبيق الحد الأدنى للتعرف على اليرقات الفردية. يتم سرد إحداثيات لكل يرقة في كل صورة، ويمكن إدراجها في ملف إكسل التي نستخدمها لقياس تجنب وthigmotaالسلوك xis، الأسماك لمسافة الأسماك، والسباحة بسرعة، وكمية من الراحة 16.
بينما نحن باستمرار تحسين مقايسة لدينا السلوكية الرواية، فقد كان دائما مفيدا للكشف عن تجنب والسلوك انجذاب بالتماس في الزرد اليرقات 15. وقد أجريت العديد من التجارب لتحسين نتائج الفحص، مثل اللون من التحفيز المستخدمة، العدد المثالي لليرقات لكل حارة، وطول الفحص السلوكية. سابقا، كنا لوحات متعددة جيدا (مع 6 أو 12 بئرا) 15،17،18. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة قمنا بإنشاء القالب حارة رواية لخلق مساحة أكبر للسباحة اليرقات مما يسمح لنا لجمع عدد أكبر من التدابير السلوكية في فحص واحد 16 (الشكل 5). وتشمل التعديلات الأخرى الاختلافات في باور بوينت عرض (حركة تغيير أو طول مقايسة) وحجم الممرات المستخدمة (لدينا أيضا قوالب للممرات الضيقة أكثر).
حاليا، وهذا النظام الآلي عالية الإنتاجية هي فريدة من نوعها في قدرتها على قياس طائفة واسعة من السلوكيات في zebrاليرقات عفيش في نفس الوقت مثل السرعة، وتجنب، والقرب من اليرقات الأخرى، وانجذاب بالتماس في لوحات متعددة الحارات. النتائج يمكن الحصول عليها بسرعة ويمكن تحليل عدد كبير من اليرقات في وقت التصوير. النظام على حد سواء غير مكلفة لبناء وسهلة وسريعة لاقامة. وجود قيود من هذا النظام هو أن الحركات 3-D لا يمكن تقييمها في اليرقات الزرد. النظم الآلية التي تتبع الزرد الكبار لديها القدرة 3-D ويمكن التعرف على مجموعة واسعة من السلوكيات مثل حركة أعلى أو لأسفل داخل عمود الماء 10،19. الحد الآخر هو أن نظام التصوير لدينا حاليا لا الأمثل للتحليلات عالية الإنتاجية في سرعة الفيديو. الفيديو التصوير السرعة هو ممكن عندما وضع الكاميرا إلى دقة أقل 15، ولكن هذا يحد من تحليل لوحة واحدة.
في استخدام طريقة "لين" التي أنشئت حديثا، يحتاج عدة أجزاء من الفحص ليتم تنفيذها بطريقة دقيقة. عند وضع اليرقات في تيانه الممرات، فمن الأهمية بمكان للتأكد من أن مستوى السائل ضحلة جدا حتى يتم وضع لوحات على الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر المحمول. إذا الممرات مليئة جدا من السائل، فإن اليرقات الهروب إلى المحيط الخارجي للوحة. وبالإضافة إلى ذلك، عند إدراج القالب في الاغاروز، يجب الحرص على خفض العفن ببطء شديد. إذا تم إدراج القالب بسرعة كبيرة جدا، وسوف تشكل فقاعات في الاغاروز وسوف يتم تحديد من قبل J الماكرو صورة كيرقات إضافية. وينصح أنه إذا الممرات الاغاروز لديهم حتى بضعة فقاعات، فمن الأفضل لجعل جديدة.
في المستقبل، نود أن تحسين مقايسة لدينا السلوكية لتحليل السلوكيات المعقدة الأخرى مثل التعلم في اليرقات الزرد ودراسة كيف يمكن أن تتأثر التعلم عن طريق التعرض للسميات والمستحضرات الصيدلانية في التنمية في وقت مبكر. ونحن نعمل حاليا على المقايسات التي قد تكون مفيدة لتحليل سلوك التعلم في النتائج السلوكية التي قد تسهل تحديد أي مناطق الدماغ هيتتأثر بعض المواد السامة أو المواد الصيدلانية خلال التنمية. وقد تم تطوير المقايسات الآلي لقياس السلوكيات في الزرد اليرقات 20 وهذه المقايسات التعلم قد تكون قابلة للتعديل لالفرز الفائق الإنتاجية باستخدام استجابة تجنب قوية في لوحات متعددة الحارات.
نقترح أن هذا الاختبار السلوكية يمكن أن تستخدم في الدراسات المستقبلية لاختبار الآثار التنموية لعدد كبير من الأدوية والمواد السامة. ان مثل هذه الدراسات توفر ثروة من المعلومات حول عوامل الخطر المحددة والمساهمة في وضع المبادئ التوجيهية للصحة والسلامة أفضل للنساء الحوامل والأطفال.
The authors have nothing to disclose.
نشكر شون Pelkowski للمساعدة في تعظيم الاستفادة من مقايسة السلوكية. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، R01 HD060647 والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، F32 ES021342 وR03 ES017755.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |