Laboratuvarımız 7 günlük eski Zebra balığı larvaları birkaç farklı davranışların tespiti için yararlı bir yeni yüksek verimli otomatik görüntüleme sistemi geliştirdi. Sistem, larva çevresel toksik ya da eczacılık maruz kalmış sonra davranış ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.
Biz çok şeritli plakalar 7 günlük eski Zebra balığı larvaları davranış analizi için yeni bir yüksek verimli görüntüleme sistemi oluşturduk. Bu sistem bir PowerPoint sunumu ile larva gösterilir spontan davranış ve caydırıcı bir uyarana tepki, ölçer. Kaydedilen görüntüler, otomatik olarak renk kanalları böler bir ImageJ makro ile analiz edilir arka plan çıkarır ve şerit bireysel larva yerleştirme tanımlamak için bir eşik geçerlidir. Daha sonra yüzme hızı, sokağın kenarına ya da yan için tercih, dinlenme davranış, thigmotaxis, larva arasındaki mesafe ve kaçınma davranışı ölçmek için bir Excel sayfası içine koordinatları alabilirsiniz. Davranış ince değişiklikler kolayca çevresel toksik maddeler veya ilaçlara maruz kaldıktan sonra davranış analizleri için yararlıdır, bizim sistemi kullanılarak tespit edilir.
Zebra balığı genetik, gelişimsel ve davranış bilimleri 1-4 için popüler bir modeli haline gelmektedir. Bunlar, 2-3 gün sonra döllenme (DPF) kendi chorions gelen yumurtadan 4-5 dpf'e tarafından tam olarak işleyen bir organ geliştirmek ve 7 dpf 5,6 ile davranışların çok sayıda sergiler. Balığı larvaları ideal nedeniyle küçük boyutu 7,8 yüksek verimlilik analizler için uygundur. Yazılım larva ve yetişkin zebrabalıkları 9-14 davranış otomatik analiz için ticari olarak temin edilebilir. Ancak bu yazılım pahalı ve çok iyi plakaları Zebra balığı larvalarının karmaşık davranışları ölçmek için sınırlı seçeneği vardır.
Biz kurmak ve 7 dpf Zebra balığı larvaları 15,16 farklı davranışlar bir dizi sayısal olarak ucuz yeni bir yüksek verimli görüntüleme sistemi oluşturdu. Sistem, bir dizi embriyonik maruz kaldıktan sonra bize hızlı ve verimli bir şekilde ince bir davranış bozukluğu test etmeye imkan vermektedirilaç ve çevresel toksik atıkları 16-18.
Sistem, kabin üstündeki evin bir dijital fotoğraf makinesi ahşap dolaplar, kullanılarak inşa edilmiştir. Kamera bir dizüstü bilgisayar 15 yukarı bakacak şekilde ekran yerleştirilir kabinin altına aşağı karşı karşıya. Zaman atlamalı görüntüleme şerit larvaların yerleştirme yakalamak için kullanılır. Larva laptop ekranın üst kısmında konumlandırılmış dört çok iyi veya çok şeritli plakalara kadar muhafaza edilebilir. Biz larva kenar (thigmotaxis) 15,17 doğru uzaklaşıyor (kaçınma) ve yüzme cevap için caydırıcı bir uyarıcı olarak bir PowerPoint sunumu kullanın. Görüntüler otomatik makro, renk kanalları bölünmüş arka plan çıkarma ve bireysel larva tanımlamak için bir eşik uygulamak için kullanıldığı ImageJ alınır. Koordinatlar her resim her larva için listelenen ve kaçınma ve thigmota ölçmek için kullanabileceğiniz bir Excel dosyasına eklenebilirxis davranış, balık mesafe balık, hız ve dinlenme 16 miktarı yüzmek.
Biz sürekli yeni davranış tahlil iyileştirilmesi olsa da, her zaman kaçınma ve Zebra balığı larvaları 15 thigmotaxis davranış tespiti için yararlı olmuştur. Pek çok çalışma, örneğin kullanılan uyarıcı renk olarak, tahlilin sonuçları optimize etmek için yapılmıştır, şerit başına larva ve davranış tahlilinde uzunluğunu doğru sayısı. Daha önce, çok iyi plakaları (6 ya da 12 kuyucuklu) 15,17,18 kullanılır. Ancak, son zamanlarda bize tek bir deneyi 16 (Şekil 5) davranışsal önlemler daha çok sayıda toplamak için izin larvaları için daha büyük bir yüzme alanı oluşturmak için yeni şerit kalıp oluşturduk. Diğer değişiklikler PowerPoint işletmeler varyasyonları (testinin değişmiş hareket ya da uzunluk) ve (biz de daha dar yolları için kalıplar var) kullanılan şerit büyüklüğü içerir.
Şu anda, bu yüksek verimli otomatik sistem ZEBR davranışları geniş bir ürün yelpazesi ölçmek için yeteneği benzersizdirBu hız, kaçınma, diğer larva yakınlık ve çok şeritli plakalar thigmotaxis aynı zamanda Afish larva. Sonuçlar hızlı bir şekilde elde edilebilir ve larva, çok sayıda görüntüleme zamanda analiz edilebilir. Sistem kurmak için oluşturmak için ucuz ve hızlı ve kolay hem de. Bu sistemin bir sınırlama 3-D hareketleri Zebra balığı larvaları değerlendirilemez olmasıdır. Yetişkin Zebra balığı izlemek otomatik sistemler 3-Ge kapasitesi var ve bu hareket yukarı veya aşağı su sütunu 10,19 içinde gibi davranışların daha geniş belirleyebilir. Başka bir sınırlama bizim görüntüleme sistemi şu anda görüntü hızda yüksek verimlilik analizleri için optimize olmasıdır. Daha düşük bir çözünürlük 15 için kamera ayarlarken video hızlı görüntüleme mümkündür, ama bu tek plaka için analiz kısıtlar.
Yeni oluşturulan "şerit" yöntemi kullanılarak, tahlil çeşitli yerlerinde hassas bir şekilde yürütülür gerekiyordu. T larvaları yerleştirirkeno şerit, bu plakalar laptop ekranın üst kısmında konumlandırılmış kadar sıvı seviyesinin çok sığ olduğundan emin olmak için önemlidir. Şerit sıvı çok dolu ise, larva plakanın çevresine kaçacak. Buna ek olarak, agaroz kalıbın, bakım zaman çok yavaş kalıp düşürmek için gerekli önlemler alınmalıdır. Kalıp çok hızlı takılırsa, kabarcıkları agaroz oluşturacak ve ek larva olarak Resim J makro tarafından tespit edilecektir. Bu agaroz şerit hatta birkaç kabarcıkları varsa, bu yenilerini yapmak için en iyi tavsiye edilir.
Gelecekte, bu tür Zebra balığı larvaları öğrenme gibi diğer karmaşık davranışları analiz ve öğrenme erken gelişiminde toksik ve ilaç maruz etkilenebilir nasıl incelemek için bizim davranış tahlil optimize etmek istiyorum. Şu anda davranışsal sonuçları beyin bölgeleri olduğu tespit kolaylaştırabilir hangi öğrenme davranışlarını analiz için yararlı olabilir testleri üzerinde çalışıyoruzgelişim sırasında bazı toksik maddeler veya ilaç etkilenir. Otomatik deneyleri Zebra balığı larvaları 20 ve bu deneylerde davranışları öğrenme çok şeritli plakalar sağlam kaçınma tepkisi kullanarak yüksek verimli tarama için iyileştirilebilir olabilir ölçmek için geliştirilmiştir.
Bu davranış tahlilinde, ilaç ve toksik maddeler, çok sayıda gelişimsel etkilerini test etmek için daha sonraki çalışmalarda kullanılabilir öneriyoruz. Bu tür çalışmalar belirli risk faktörleri üzerine bilgi hazinesi sağlamak ve hamile kadınlar ve çocuklar için daha iyi sağlık ve güvenlik kurallarına ayar katkıda bulunacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Biz davranış testinin optimizasyonu yardım için Sean Pelkowski teşekkür ederim. Bu çalışma Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Ulusal Enstitüsü, R01 HD060647 ve Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü, F32 ES021342 ve R03 ES017755 tarafından desteklenmiştir.
Reagent | |||
Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
Equipment | |||
One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
Digital camera | Canon | EOS Rebel T1i | |
Imaging Cabinets | WoodCraft Towers | ||
Laptops | Acer Aspire | Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2. | |
Camera Lens | Canon | EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens | |
Plastic diffuser | Pendaflex | 52345 | |
Software | |||
PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Excel 2010 | Microsoft | ||
Statistical software | SPSS 20 |