Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas
Summary
Isolamento e caracterização do domínio de lípido A do lipopolissacárido (LPS) da bactéria gram-negativa proporciona uma visão sobre os mecanismos da superfície celular com base de resistência ao antibiótico, a sobrevivência das bactérias e forma, e como quimicamente lípido A diversidade de espécies moleculares diferencialmente hospedeiras modular respostas imunitárias inatas.
Abstract
O lipopolissacárido (LPS) é a maior molécula da superfície celular de bactérias gram-negativas, depositado em monocamada externa da bicamada da membrana externa. LPS pode ser subdividida em três domínios: o distal O-polissacáridos, oligossacáridos um núcleo, e o lípido A domínio constituído por um lípido A espécie molecular e radicais de ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (Kdo). O domínio de lípido A é o único componente essencial para a sobrevivência da célula bacteriana. Após a sua síntese, o lípido A é quimicamente modificado em resposta a tensões ambientais tais como o pH ou da temperatura, para promover a resistência a compostos antibióticos, e para evitar o reconhecimento por mediadores da resposta imune inata hospedeiro. O protocolo seguinte fornece detalhes sobre o isolamento em pequena e grande escala de lípido A de bactérias Gram-negativas. Isolado de material é, então, caracterizada quimicamente por cromatografia em camada fina (TLC) ou por espectrometria de massa (MS). Em adição à matriz assistida por laser de dessorção / ionização-tempo de fluz (MALDI-TOF) MS, que também descrevem em tandem protocolos MS para análise de lipídios A espécie molecular utilizando ionização por electrospray (ESI) acoplado a colisão induzida dissociação (CID) e fotodissociação ultravioleta recém-contratados (UVPD) métodos. Os nossos protocolos MS permitir a determinação inequívoca da estrutura química, fundamental para a caracterização de moléculas de um lípido que contêm modificações químicas únicas ou novos. Nós também descrevem a rotulagem radioisotópica, e posterior isolamento, de lipídios A partir de células bacterianas para análise por TLC. Em relação a protocolos baseados em MS, TLC fornece um método de caracterização mais económica e rápida, mas não pode ser utilizada para atribuir inequivocamente lípido A estrutura química, sem o uso de padrões de estrutura química conhecida. Ao longo das duas últimas décadas, o isolamento e caracterização de lípido A levou a numerosas descobertas interessantes que melhoraram a compreensão da fisiologia das bactérias gram-negativas, os mecanismos de resistência a antibióticoscia, a resposta imune inata humana, e forneceram muitos novos alvos para o desenvolvimento de compostos antibacterianos.
Introduction
O lipopolissacárido (LPS) é a maior molécula de superfície externa de praticamente todos os organismos gram-negativas e consiste de três domínios: um moleculares polissacáridos distal-O antigénio, um núcleo de oligossacáridos, e o lipídicas associadas à membrana Um domínio depositado no folheto exterior da exterior da membrana em bicamada 1,2. O lípido A domínio consiste em 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (Kdo) e resíduos de um lípido A de espécies moleculares, em que o lípido A pode ser definido como a porção solúvel em clorofórmio de LPS durante a hidrólise com ácido fraco 1, 2. O lípido padrão A molécula pode ser quimicamente definido como uma espinha dorsal diglucosamine que é fosforilado e bis-acilado-hexa; consistente com as espécies principais lípido A observados no modelo de organismo de Escherichia coli (E. coli), 1,2. Nove genes expressos constitutivamente, conservadas ao longo de bactérias gram-negativas, são responsáveis pela produção do lípido A do domínio (Figura 1) 1,2. A maioria das bactérias têm um conjunto adicional de genes, que variam em grau de conservação filogenética, que participam de uma nova modificação química de lipídios A 3. Desfosforilação, a remoção de cadeias de acilo, e a adição de porções químicas, tais como os açúcares (por exemplo, idos aminoarabinose) e / ou fosfoetanolamina são as actividades mais comumente observados (Figura 1). Muitas das enzimas responsáveis pela modificação do lípido A são directamente accionados por sinais ambientais, tais como catiões divalentes, ou a sua expressão é regulada por dois sistemas de resposta de regulador do componente 3.
Reconhecimento de espécies de um lípido pelo sistema imune inato hospedeiro é mediada pelo receptor Toll-like factor de diferenciação 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Forças hidrofóbicas entre MD2 e o lípido A cadeias acilo, bem como entre TLR4 e dos grupos de fosfato 1 e 4 de lípido A promovem a forte associação do lábioUm ID com TLR4/MD2 4,5. As modificações que alteram estado acilação ou a carga negativa de lípido A de lípidos com base impacto TLR4/MD2 Um reconhecimento e a jusante da estimulação da resposta imune inata activadores do NF-kB e de mediadores da inflamação, tais como TNFa e IL-1-β 6,7. Modificações que mascarar a carga negativa de lípido A, também impedir que os péptidos antimicrobianos catiónicos bactericidas de ligação a bactérias gram-negativas superfícies celulares 3,8. Muitas modificações lipídico A são a hipótese de aumentar a aptidão de bactérias em condições ambientais específicas, como no interior do hospedeiro humano ou em um nicho ecológico. Por esta razão, muitas enzimas de modificação são alvos atraentes para o desenvolvimento racional de compostos antimicrobianos. A diversidade química das estruturas um lipídio, em relação ao organismo e / ou meio ambiente, e as implicações biológicas destas diversas estruturas fazer a caracterização estrutural de lipídios A um esforço importante em tele estudar de bactérias gram-negativas.
Isolamento de moléculas de um lípido de bactérias inteiras envolve a extracção de LPS a partir da superfície celular bacteriana, um passo hidrolítico para libertar o lípido A, seguido de um procedimento de purificação final 9-11. O procedimento de extração mais citados LPS é o procedimento de extracção de água quente-fenol, introduzido pela primeira vez por Westphal e Jann 10. Depois de toda a extracção de LPS é submetido a hidrólise com ácido fraco, o qual separa quimicamente Kdo do 6'-hidroxilo do açúcar glucosamina distal do lípido A (Figura 1). Existem numerosos perigos para o procedimento de água quente-fenol, incluindo o uso de um reagente de risco elevado, a necessidade de degradar os ácidos nucleicos extraídos de co-e proteínas, e vários dias são necessários para completar o protocolo de 10.
Nosso laboratório desenvolveu ainda mais a extração e isolamento de lipídio A como o primeiro desenvolvido pela Caroff e Raetz 12,13. Em comparação com os procedimentos de água quente-fenol, o método aqui apresentado é mais rápida e eficiente e acomoda uma larga gama de volumes de cultura de 5 ml para vários litros. Além disso, ao contrário de extrações de água quente-fenol, o nosso método não seleciona para ásperas ou lisas-tipos de LPS, proporcionando ótima recuperação de espécies um lipídio. No nosso protocolo de lise química de células bacterianas inteiras é realizada utilizando uma mistura de clorofórmio, metanol e água, onde LPS pode ser sedimentado por centrifugação. Uma combinação de hidrólise com ácido fraco e extracções com solvente (Bligh-Dyer) são usados para libertar o lípido A de polissacárido covalentemente ligado. O método de Bligh e Dyer foi aplicada primeiramente para a extracção de lípidos de espécies a partir de uma variedade de animais e de tecidos vegetais 14, modificado aqui para separar polissacárido hidrolisada de lípido A. Nesta etapa final de separação, lípidos solúveis clorofórmio particionar selectivamente para a fase orgânica inferior fase. Para purificar ainda mais o lípido A, de fase inversa oucromatografia de coluna de troca aniónica pode ser usado 12.
Após o isolamento de espécies de um lípido de células completas, uma série de métodos analíticos pode ser utilizado para caracterizar a estrutura química do material isolado, tais como RMN, TLC e análise baseada em MS. RMN permite a elucidação estrutural não-destrutiva, e fornece detalhe estrutural relacionada com ligações glicosídicas, atribuição inequívoca de posições cadeia acil e atribuição de pontos de ligação para modificações um lipídio como aminoarabinose ou phosphoethanolamine 15-17. A análise de RMN de lípido A não é discutido no nosso protocolo, mas foi descrito em outro lugar adequadamente 15,16. Para a análise rápida TLC com base métodos são frequentemente utilizados, mas não fornecem informação directa sobre a estrutura química fina. Protocolos baseados MS são o método mais empregado para caracterizar estruturas um lipídio 18,19. Matriz associada a laser dessorção por ionização (MALDI)-MS é muitas vezes usado para examinar inicialmente espécies intactas lipídico A. Íons de carga única são gerados a partir do analito preparadas de acordo com os nossos procedimentos de extração. Como é necessária a análise estrutural mais fina, métodos baseados em MS / MS provar mais informativo do que MALDI-MS. Acoplado a ionização electrospray (ESI) lipídico isoladamente ou multiplicar cobrada uma íons precursores são ainda mais fragmentado por colisão induzida dissociação (CID) ou fotodissociação ultravioleta (UVPD), para gerar íons produtos estruturalmente informativos 18,20,21. Produtos da perda neutra do lipídio A íons precursores também são freqüentemente gerados durante ESI-MS fornecer uma camada adicional de informações estruturais.
Espectrometria de massa em tandem (MS / MS) provou ser um método indispensável e versátil para a elucidação da estrutura de um lípido. Durante a MS / MS, os iões são activados para proporcionar um padrão de fragmentação de diagnóstico que pode ser utilizado para elucidar a estrutura do ião precursor. O mais amplamente available método MS / MS é CID. Este método produz iões fragmento através de colisões ião precursor seleccionado com um gás inerte alvo, resultando em deposição de energia que leva à dissociação. CID provou uma ferramenta fundamental na atribuição de lípido A estrutura para uma ampla gama de espécies bacterianas 22-33.
Embora CID é o método MS / MS mais universalmente implementado, ele gera um conjunto limitado de íons de produtos. 193 nm UVPD é uma alternativa e complementar método MS / MS. Este método utiliza um laser para irradiar iões, e a absorção de fotões resulta na activação dos iões e dissociação subsequente. Esta maior energia técnica MS / MS produz um conjunto mais diversificado de íons produtos que CID e, portanto, fornece padrões de fragmentação mais informativas. Em particular, UVPD oferece informações sobre mudanças sutis em espécie um lipídio com base em clivagens no glicosídica, amina, acil e CC ligado títulos 18,21,34.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo temos detalhou o isolamento de espécies de um lipídio a partir de células inteiras de bactérias, e descreveu TLC ou métodos analíticos baseados MS caracterizar quimicamente o material isolado. Espectrometria de massa em tandem é uma estratégia poderosa para de novo caracterização estrutural de compostos biológicos, e é de valor inestimável para a caracterização química da panóplia de moléculas de um lipídio observadas na natureza. CID e UVPD são dois métodos de ativação co…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios AI064184 e AI76322 dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e por Grant 61789-MA-MUR do Army Research Office para MST A pesquisa também foi apoiado por Welch Foundation Grant F1155 e NIH conceder R01GM103655 a JSB
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
| Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mass Spectrometer | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
| Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
Referências
- Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
- Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
- Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
- Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
- Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
- Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
- Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
- Westphal, O. a. J., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
- Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
- Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
- Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
- Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
- Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Bioquímica. 45, 14427-14440 (2006).
- Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
- Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
- Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
- Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
- Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
- Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
- Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
- Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
- El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
- Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
- Lee, C. -. S., Kim, Y. -. G., Joo, H. -. S., Kim, B. -. G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
- Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
- Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
- Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -. L., Afonso, C., Tabet, J. -. C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
- Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
- Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
- Jones, J. W., Cohen, i. e., Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
- Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
- Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
- Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
- Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
- Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
- Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
- Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
- Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).
