JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

Выделение и химическая характеристика липида А из грамотрицательных бактерий

Published: September 16, 2013
doi:
10.3791/50623
, , ,
1Section of Molecular Genetics and Microbiology,The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry,The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology,The University of Texas at Austin

Summary

Выделение и характеристика области липида А липополисахарида (ЛПС) из грамотрицательных бактерий дает представление о клеточной поверхности механизмов, основанных устойчивости к антибиотикам, выживаемости бактерий и пригодности, и как химически разнообразны липид А молекулярные частицы дифференциально модулировать хост врожденные иммунные реакции.

Abstract

Липополисахарид (LPS) является основным молекулу клеточной поверхности грамотрицательных бактерий, наносят на наружный листок наружной мембраны бислой. ЛПС можно разделить на три области: дистальный О-полисахарида, основной олигосахаридными и липидов область, состоящая из липида A молекулярные частицы и остатки 3-дезокси-D-манно-окт-2-ulosonic кислоты (КДО). Домен липидов является единственным компонентом важное значение для выживания бактериальной клетки. После его синтеза, липидов химически модифицирован в ответ на экологических стрессов, таких как рН или температуры, в целях содействия устойчивость к антибиотикам соединений, и уклониться от признания медиаторов принимающей врожденного иммунного ответа. Ниже подробно описывается протокол малого и масштабный изоляцию липида А из грамотрицательных бактерий. Изолированный материал затем химически охарактеризован с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) или масс-спектрометрии (МС). В дополнение к матрице-лазерной десорбцией / ионизации-время фсвет (MALDI-TOF) МС, мы также описать тандем MS протоколы для анализа липида А молекулярные частицы с помощью ионизации электрораспылением (ESI), соединенный с столкновения индуцированной диссоциации (CID) и вновь принятых на работу ультрафиолетовое фотодиссоциацию методы (UVPD). Наши протоколы MS позволяют однозначного определения химической структуры, первостепенное значение для характеристики липидных молекул А, которые содержат уникальные или новые химические модификации. Мы также описываем радиоизотопное мечение, и последующее выделение, из липида А из бактериальных клеток для анализа с помощью ТСХ. По сравнению с протоколами MS на основе ТСХ обеспечивает более экономичный и быстрый метод характеризации, но не могут быть использованы для однозначно назначать липида А химические структуры без использования стандартов известной химической структуры. За последние два десятилетия выделение и характеристика липида А привело к многочисленным захватывающих открытий, которые улучшили наше понимание физиологии грамотрицательных бактерий, механизмов сопро антибиотиковрасстояние, человеческий врожденного иммунного ответа, и предоставили много новых целей в развитии антибактериальных соединений.

Introduction

Липополисахарид (LPS) является основным внешняя поверхность молекула почти всех грамотрицательных микроорганизмов и состоит из трех доменов: молекулярных дистальный O-антиген полисахаридов, основной олигосахаридных, и мембранно-связанный липидов домена осаждается на внешней створки Внешняя мембрана двухслойная 1,2. Липидный домен состоит из 3-дезокси-D-манно-окт-2-ulosonic (KDO) остатков и липида A видов молекул, где липид может быть определена как хлороформ растворимой части ЛПС при легкой кислотного гидролиза 1, 2. Стандарт липидов молекула может быть химически определяется как diglucosamine позвоночника, что является гекса-ацилирована и бис-фосфорилируются; согласуется с основными видами липида А, наблюдаемых в модель организма кишечной палочки (E.coli) 1,2. Девять конституитивно выраженные гены, консервативные по всей грамотрицательных бактерий, несут ответственность за производство липидов домена (рис. 1) 1,2. Большинство бактерий имеют дополнительный набор генов, которые изменяются в степени филогенетического сохранения, что участвовать в дальнейшей химической модификации липидов 3. Дефосфорилирование, удаление ацильных цепей, и добавление химических групп, таких как аминосахаров (например aminoarabinose) и / или фосфоэтаноламин являются наиболее часто наблюдается деятельности (рис. 1). Многие из ферментов, ответственных за липидов модификации непосредственно активировать окружающей среды сигналов, таких как двухвалентные катионы, или их экспрессия регулируется двухкомпонентных ответ-регуляторных систем 3.

Признание видов липидов А принимающей врожденной иммунной системы опосредуется звонок подобный рецептор фактора 4/myeloid дифференциации 2 (TLR4/MD2) корецептора 4. Гидрофобные силы между MD2 и липида A ацильных цепей, а также между TLR4 и 1 и 4 'фосфатными группами липида А способствующих сильную связь для губID с TLR4/MD2 4,5. Модификации, которые изменяют состояние ацилирования или отрицательный заряд липидов липидов на основе воздействия TLR4/MD2 признание и вниз по течению стимуляция врожденного иммунного ответа активаторы NF-kB и медиаторы воспаления, такие как TNF-и IL-1 β 6,7. Модификации, которые маскируют отрицательный заряд липида А также предотвратить бактерицидными катионные антимикробные пептиды от привязки к грамотрицательных поверхности клеток 3,8. Многие модификации липидов A предположили увеличить бактериальную фитнес при определенных условиях окружающей среды, таких как внутри человеческого организма или в экологической ниши. По этой причине многие модификации ферменты привлекательными объектами в рациональной разработке антимикробных соединений. Химический разнообразие структур липида А, в отношении организма и / или окружающей среды и биологических последствий этих различных структур сделать структурную характеристику липида А важным стремиться в тон изучению грамотрицательных бактерий.

Выделение молекул липида А из цельных бактерий включает экстракцию ЛПС от поверхности бактериальной клетки, стадии гидролиза, чтобы освободить липидный A, с последующим окончательным процедуры очистки 9-11. Наиболее часто приводимые ЛПС процесс экстракции процедура забора воды горячей фенол, впервые введенная Вестфаль и Янн 10. После экстракции весь LPS подвергают легкой кислотного гидролиза, который химически отделяет Kdo от 6'-гидроксила дистального глюкозамина сахара липида А (рис. 1). Существует множество подводных камней для процедуры воды горячей фенола том числе с использованием высокой реагента опасности, необходимость ухудшить сотрудничество извлеченные нуклеиновых кислот и белков, и несколько дней, необходимых для завершения протокол 10.

Наша лаборатория дальнейшее развитие добычи и изоляцию липида А как впервые разработана Карофф и Raetz 12,13. По сравнению с процедурами горячей воды фенол, метод, представленный здесь является более быстрым и эффективным, и вмещает широкий спектр объемов культуры от 5 мл до нескольких литров. Кроме того, в отличие от экстракции горячей фенольных водных, наш метод не выбрать для грубых или гладких-типов ЛПС, обеспечивая оптимальное восстановление видов липидов А. В нашем протокола, химической лизис бактериальных клеток целых выполняется с использованием смеси хлороформа, метанола и воды, где LPS может быть осаждают центрифугированием. Сочетание гидролиза легкой кислоты и экстракции растворителем (Блай-Дайер) используются, чтобы освободить липидный А из ковалентно связанного полисахарида. Способ Блаем и Dyer впервые был применен к добыче видов липидов из различных животных и растительных тканей 14, модифицированный здесь, чтобы отделить гидролизованный полисахарид из липидов А. В этом заключительном этапе разделения, хлороформ растворимые липиды селективно разделить на нижний органический фаза. Для дальнейшей очистки липид А, с обращенной фазой илиАнионный обмен колоночной хроматографии можно использовать 12.

После выделения липидов А из видов целых клеток, ряд аналитических методов может быть использован, чтобы охарактеризовать химическую структуру изолированного материала, такого как ЯМР, ТСХ и МС на основе анализа. ЯМР позволяет неразрушающего структурного анализа, и обеспечивает структурную деталь, связанную с гликозидных связей, однозначного присвоения ацильных позиций цепи, и назначение участков присоединения для липидных модификаций А ​​как aminoarabinose или фосфоэтаноламин 15-17. ЯМР-анализ липида А не обсуждается в рамках нашего протокола, но был описан адекватно в другом месте 15,16. Для экспресс-анализа ТСХ Методы, основанные на часто используются, но не в состоянии обеспечить прямую информацию о тонкой химической структуры. Протоколы, основанные МС наиболее часто используется метод для характеристики структуры липидов 18,19. Матрица связано с лазерной десорбцией ионизации (MALDI)-MS часто используется для обследования первоначально интактные видов липида А. Однозарядных ионов сгенерированы анализируемого вещества, полученного в соответствии с нашими процедурами экстракции. Как требуется более тонкая структурный анализ, методы, основанные MS / MS оказаться более информативным, чем MALDI-MS. В сочетании с ионизацией электрораспылением (ESI), отдельно или многозарядных липид А ионы-предшественники являются еще фрагментирован на столкновения индуцированной диссоциации (CID) или ультрафиолетового фотодиссоциации (UVPD), для генерации структурно информативные ионы продукта 18,20,21. Обычный потери продуктов из липида А предшествующих ионов также часто генерируется во время ESI-MS обеспечивает дополнительный слой структурной информации.

Масс-спектрометрия Тандем (MS / MS), оказалось, незаменимым и универсальным методом для выяснения структуры липида А. Во MS / MS, ионы активируются, чтобы получить диагностическую картину фрагментации, которая может использоваться для выяснения структуру иона-предшественника. Наиболее широко лавинтестированию нет доступа метод MS / MS является CID. Этот метод производит ионы фрагментов через столкновениях выбранного иона-предшественника с инертным целевого газа, в результате чего энерговклада, что приводит к диссоциации. CID доказала критический инструмент в присвоении липидной структуры A для широкого круга видов бактерий 22-33.

Хотя CID является наиболее широко реализованы способ МС / МС, он генерирует ограниченный спектр ионов продукта. 193 нм UVPD является альтернативой и дополнительный метод MS / MS. Этот метод использует лазер для облучения ионами, и поглощение фотонов приводит к подаче напряжения ионов и последующей диссоциации. Это более высокая энергия MS / MS техника производит более разнообразные ионов продукции, чем CID и таким образом обеспечивает более информативные модели фрагментации. В частности, UVPD дает информацию о тонких изменений в видов липидов А на основе раскола в гликозидной, амин, ацил и CC облигаций, привязанных к 18,21,34.

Protocol

Все растворы должны быть подготовлены сверхчистой водой и ВЭЖХ метанола и хлороформа. Готовые решения, которые содержат органические растворители, такие как метанол, хлороформ или пиридин и концентрированных кислот или оснований должны быть подготовлены и используются по химическом…

Representative Results

Каноническое липидов Е. палочка и Salmonella enterica серовар Typhimurium является гекса-ацилированный дисахарид глюкозамина с фосфатных групп в 1 – и 4 '-положениях. Во время роста в богатых средств массовой информации (например, Лурия Бульон) часть липида А содержит пирофосфат группу…

Discussion

В этом протоколе мы подробно изоляцию липидных видов А из целых клеток бактерий, и описаны TLC или аналитические методы, основанные MS химически характеризуют этот изолированный материал. Тандемной масс-спектрометрии является мощной стратегией для процессов нового структурной хар…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами AI064184 и AI76322 от Национальных Институтов Здоровья (NIH) и Грант 61789-MA-МУР от Research Office армии к MST исследований была также поддержана Welch Foundation Grant F1155 и NIH грант R01GM103655 в АБ

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. a. J., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Bioquímica. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -. S., Kim, Y. -. G., Joo, H. -. S., Kim, B. -. G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -. L., Afonso, C., Tabet, J. -. C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, i. e., Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Tags

LipopolysaccharideLipid AGram-negative BacteriaCell Surface MoleculeChemical CharacterizationMass SpectrometryThin Layer ChromatographyInnate Immune ResponseAntibiotic Resistance

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Henderson, J. C., O’Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image