Cooperação entre um oncogene ativado como RAS V12 e mutações em genes de polaridade celular como íntima, resultar em crescimento do tumor em Drosophila, onde as células tumorais também exibem comportamentos invasivos. Aqui, um protocolo simples para a indução e observação dos tumores benignos e invasoras é apresentado.
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Artigo de método
Um protocolo para indução genética e Visualização de tumores benignos e invasoras em Cephalic Complexos de
Neste artigo
Resumo
Resumo
Drosophila tem iluminado o nosso entendimento da base genética do desenvolvimento normal e da doença para as últimas décadas e hoje continua a contribuir imensamente para a nossa compreensão de doenças complexas 1-7. Progressão de tumores benignos de um para um estado metastático é um evento complexo 8 e foi modelado em Drosophila para nos ajudar a entender melhor a base genética da doença 9. Aqui eu apresento um protocolo simples para induzir geneticamente, observar e, em seguida, analisar a progressão de tumores em larvas de Drosophila. A técnica de indução de tumores baseia-se no sistema MARCM 10 e explora a cooperação entre um oncogene activado, Ras V12 e perda dos genes de polaridade celular (íntima, discos larvas grandes e letal gigante) para gerar tumores invasivos 9. I demonstram como esses tumores podem ser visualizados no larvas intacta eentão como estes podem ser dissecados para análise posterior. O protocolo simplificado aqui apresentados devem tornar possível que esta técnica para ser utilizado pelos investigadores interessados na compreensão da função de um gene na invasão tumoral.
Introdução
Progressão de tumores benignos de um para um estado metastático é um processo de passo sábio que é caracterizada por a evasão de mecanismos de protecção presentes no corpo 8. Por exemplo células tumorais no corpo deve ser capaz de evitar a apoptose e do sistema imunológico, avanço da matriz extracelular especializada (ECM) chamado Membrana Basal, e superar todos os controles sociais impostas pelas células vizinhas 8. É através de uma progressão sábio passo que as células cancerosas adquirem a capacidade de migrar e colonizar locais distantes em um processo chamado metástase. A nossa compreensão de como a célula tumoral supera as barreiras impost....
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Protocolo
1. Indução de tumores benignos não-invasivos
- Use ações listadas na Tabela 2 para a indução de tumores benignos.
- Prepare uma cultura de partida para o "testador" balanço da seguinte genótipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
- Prepare uma cultura inicial para o estoque "testado" do seguinte genótipo: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo
- Colete dez fêmeas virgens do estoque "tester" e dez homens do estoque "testado".
- Cruze os machos e fêmeas do "testador" e o estoque "testado", colocando-os tanto em um frasco com alimentos mosca.
- ....
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Resultados
Como um resultado do protocolo apresentado aqui o utilizador irá ser capaz de induzir a superexpressão de tumores benignos por um oncogene activado no olho antenal disco imaginal larval. O utilizador também será capaz de induzir tumores invasivos no disco antenal olho por sobre-expressam um oncogene activado, em clones de células também para um mutante do gene da polaridade celular. Os tumores podem ser facilmente visualizadas com a ajuda de um estereomicroscópio fluorescente como o tecido "fluorescente verde".......
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Discussão
O cancro é uma doença complexa, com uma muito melhor compreensão hoje do que no passado. No entanto, ainda há muito a ser aprendido e explicou, antes de ter um quadro completo dos mecanismos subjacentes. O protocolo simples aqui apresentada torna possível induzir geneticamente tumores benignos e invasivos num organismo inteiro e depois estudar a biologia associada com a progressão de tumores neste modelo. A maioria das técnicas existentes em Drosophila e outros organismos ou utilizar um sistema de cultura de cé.......
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Divulgações
Eu não tenho nada a divulgar.
Agradecimentos
A pesquisa em meu laboratório é apoiado pelo Departamento WKU de fundos de arranque Biologia, WKU Research Foundation RCAP-I conceder # 11-8032 e por uma concessão KBRIN-AREA financiado através de uma subvenção pai do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais da Saúde sob o número prêmio 5P20GM103436-13. Gostaria também de agradecer Dr. Tian Xu, em cujo laboratório fui apresentado a esta técnica e Dr. Raymond Pagliarini que primeiro estabeleceu esta técnica em laboratório Xu.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10X PBS (solução salina tamponada com fosfato) pH 7.2 solução estoque | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Resfriado 1X PBS pH7.2 solução de trabalho | Invitrogen, Sigma Aldrich | Faça fresco e refrigere, pode ser usado por até uma semana | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Anestesia com mosca necessária para anestesiar larvas | |
| Fixador | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldeído | Necessário para consertar o complexo cefálico dissecado | |
| Balde de gelo | Várias | soluções de manutenção no gelo. Além disso, disseque o complexo cefálico em PBS 1X resfriado e, em seguida, coloque no gelo em um tubo Eppendorf | |
| de 1,7 ml Tubo Eppendorf | Várias | ||
| lâminas de vidro, vidro de cobertura | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media ou qualquer outro meio de montagem | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 ou 700 Oil | Polysciences Inc. ou Halocarbon.com | Halocarbon 200 é usado para montar as larvas para visualização em um estereoscópio de fluorescência | |
| Esmalte de unhas "Hard as Nails" da Sally Hansen | Pode ser encontrado em qualquer loja | Necessário para selar as bordas da lamínula | |
| A Estereomicroscópio de fluorescência Leica MZ16.5 ou qualquer outro estereomicroscópio de fluorescência | Leica e outros | Necessário para observar a fluorescência GFP em larvas | |
| Fórceps Dumont #5 | Ferramentas | ||
| fina Placa de ponto de 9 poços Pyrex ou qualquer outro prato de dissecação | Pincel Sigma Aldrich | ||
| Pode ser encontrado em qualquer loja | |||
| Tabela 1. Materiais necessários para realizar o protocolo experimental apresentado neste artigo. | |||
Referências
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M.
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Reimpressões e permissões
