En computer-assisteret Multi-elektrode Patch-clamp System
Summary
Multi-elektrode patch-clamp optagelser udgør en kompleks opgave. Her viser vi, hvordan, ved at automatisere mange af de eksperimentelle trin, er det muligt at fremskynde processen, der fører til kvalitativ forbedring af ydeevne og antallet af optagelser.
Abstract
Plasteret-clamp teknik er i dag den mest veletablerede metode til optagelse af elektrisk aktivitet fra de enkelte neuroner eller deres subcellulære afsnit. Ikke desto mindre opnå stabile optagelser, selv fra enkelte celler, er fortsat en tidskrævende procedure betydelig kompleksitet. Automatisering af mange skridt i forbindelse med en effektiv information display i høj grad kan hjælpe eksperimentalister i at udføre et større antal optagelser med større pålidelighed og på kortere tid. For at opnå store optagelser konkluderede vi den mest effektive fremgangsmåde er ikke fuldt ud automatisere processen, men at forenkle de eksperimentelle trin og reducere chancerne for menneskelige fejl, mens effektivt indarbejde eksperimentatorens erfaring og visuel feedback. Med disse mål for øje har vi udviklet en computer-assisteret system, som centraliserer alle de nødvendige foranstaltninger for en multi-elektrode patch-clamp eksperiment i et enkelt interface, en commercially tilgængelige trådløse gamepad, mens der vises eksperiment relateret information og vejledning tidskoder på computerskærmen. Her beskriver vi de forskellige dele af systemet, der tillod os at reducere den tid, der kræves for at opnå optagelse konfiguration og øge chancerne for en vellykket optagelse stort antal neuroner samtidigt.
Introduction
Evnen til at optage og stimulere flere steder med mikrometer præcision er særdeles nyttig for eksperimentelt at opnå en bedre forståelse af neuronale systemer. Mange teknikker er blevet udviklet til dette formål, men ingen mulighed for submillivolt opløsning opnås ved patch-clamp teknik, der er afgørende for at studere subthreshold aktivitet og individuelle postsynaptiske potentialer. Her dækker vi udviklingen af en tolv-elektrode computer-assisteret patch-clamp system til samtidig optagelse og stimulere et stort antal individuelle celler med tilstrækkelig præcision til studiet af neuronal tilslutningsmuligheder. Mens mange andre applikationer kan tænkes for et sådant system, det egner sig særligt godt til studiet af synaptisk forbindelse givet, at antallet af mulige forbindelser inden for en gruppe af neuroner vokser proportionalt med kvadratet på antallet af neuroner pågældende. Derfor, mens et system med tre elektroder tillader afprøvning afforekomsten af op til seks forbindelser og oftest optage en enkelt, optagelse tolv neuroner tillader afprøvning af forekomsten af op til 132 forbindelser og ofte observere over et dusin (figur 1). Observationen af snesevis af tilslutninger samtidigt gør det muligt at analysere organiseringen af små netværk og udlede statistiske egenskaber nettets struktur, som ikke kan probede ellers 1.. Desuden præcis stimulering af talrige celler giver også mulighed for kvantificering af rekruttering af postsynaptiske celler 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
En umiddelbar spørgsmål opstår normalt, om graden af succes af den procedure, vi beskrevet. Ved høje succesrater forberedelse er vigtig. Pipetter skal have tip åbninger, der er passende til de celler væsener optaget. Filtrering af intracellulære løsning for at undgå tilstoppede pipetter er også vigtig. Ekstremt rene, frisktappet pipetter er et andet krav. En binomialfordeling er den simpleste model, der kan bruges til at forstå, hvordan disse problemer påvirker det endelige udbytte. Det er rimeligt at …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi og Sonia Garcia for værdifuld rådgivning om forbedringer for patch-clamp procedure automatisering. Vi takker Rajnish Ranjan for værdifuld rådgivning og bistand med software implementering. Dette arbejde blev finansieret delvist af EU Synapse-projektet og dels af Human Frontier Science Program.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
Referências
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
