Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System
Summary
Multi-elektrode patch-clamp vormen een complexe taak. Hier laten we zien hoe, door het automatiseren van veel van de experimentele stappen is het mogelijk om het proces dat tot kwalitatieve verbetering van de prestaties en het aantal opnamen versnellen.
Abstract
De patch-clamp techniek is vandaag de dag de meest bekende methode voor het opnemen van elektrische activiteit van individuele neuronen of de subcellulaire compartimenten. Toch een stabiele opnamen, zelfs individuele cellen, blijft een tijdrovende procedure bijzonder complex. Automatisering van de vele stappen in combinatie met een efficiënte informatiedisplay kan sterk experimentalisten bij het uitvoeren van een groter aantal opnames met grotere betrouwbaarheid en in minder tijd. Om grootschalige opnames realiseren concludeerde we de meest efficiënte aanpak is niet om volledig te automatiseren het proces, maar om de experimentele stappen te vereenvoudigen en verminderen de kans op menselijke fouten tijdens het efficiënt opnemen van de ervaring van de experimentator en visuele feedback. Met deze doelstellingen in het achterhoofd een computerondersteund systeem dat alle noodzakelijke controles centraliseert voor een multi-elektrode patch-clamp experiment in een enkele interface, een commerc ontwikkelden weially beschikbare draadloze gamepad, tijdens het weergeven van experiment gerelateerde informatie en begeleiding aanwijzingen op het computerscherm. Hier beschrijven we de verschillende onderdelen van het systeem die ons toeliet om de tijd die nodig is voor het bereiken van de opname configuratie verlagen en aanzienlijk verhogen de kans op grote aantallen neuronen tegelijk met succes opnemen.
Introduction
Het vermogen opnemen en stimuleren meerdere sites met micrometer precisie is uitermate geschikt voor experimenteel een beter begrip van neuronale systemen. Vele technieken zijn ontwikkeld om dit doel maar niemand kan de submillivolt resolutie bereikt door de patch-clamp techniek, essentieel voor het bestuderen subklinische activiteit en individuele postsynaptische potentialen. Hier bespreken we de ontwikkeling van een twaalf-elektrode computerondersteunde patch-clamp systeem gericht op het gelijktijdig opnemen en stimuleren een groot aantal individuele cellen met voldoende nauwkeurigheid voor de studie van neuronale connectiviteit. Terwijl vele andere toepassingen denkbaar voor een dergelijk systeem leent zich bijzonder goed voor de studie van synaptische connectiviteit aangezien het aantal mogelijke verbindingen binnen een groep van neuronen groeit evenredig met het kwadraat van het aantal neuronen betrokken. Daarom, terwijl een systeem met drie elektroden maakt het testenoptreden van maximaal zes verbindingen en meestal een enkele opname, opname twaalf neuronen kan het testen van de aanwezigheid van maximaal 132 verbindingen en vaak observeren dan een dozijn (figuur 1). De waarneming van tientallen verbindingen tegelijkertijd maakt het mogelijk om de inrichting van kleine netwerken te analyseren en afleiden statistische eigenschappen van de netwerkstructuur die anders 1 kan worden gesondeerd. Bovendien precieze stimulatie van talrijke cellen maakt het ook mogelijk de kwantificering van de aanwerving van postsynaptische cellen 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een onmiddellijke vraag ontstaat meestal over de mate van succes van de procedure die wij beschreven. Voor hoge slagingspercentages voorbereiding is essentieel. Pipetten moeten hebben tip openingen die geschikt zijn voor de cellen wezens opgenomen zijn. Filtreren van de intracellulaire oplossing verstopte pipetten voorkomen is ook belangrijk. Zeer schoon, vers getapt pipetten zijn een andere eis. Een binomiale verdeling is het eenvoudigste model dat kan worden gebruikt om te begrijpen hoe deze problemen beïnvloeden de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi en Sonia Garcia bedanken voor waardevolle adviezen over verbeteringen voor de patch-clamp procedure automatisering. Wij danken Rajnish Ranjan voor waardevolle adviezen en assistentie software implementatie. Dit werk werd deels gefinancierd door de EU Synapse-project en deels door het Human Frontier Science Program.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
Referências
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
