מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב
Summary
הקלטות תיקון מהדק Multi-אלקטרודה מהוות משימה מורכבת. כאן אנו מראים כיצד, על ידי אוטומציה של רבים מהשלבים הניסיוניים, זה אפשרי כדי להאיץ את התהליך מוביל לשיפור איכותי בביצועים ומספר ההקלטות.
Abstract
טכניקת התיקון-clamp היא כיום השיטה הכי המבוססת היטב להקלטת פעילות חשמלית מנוירונים בודדים או תאי subcellular שלהם. עם זאת, להשגת הקלטות יציבה, גם מהתאים בודדים, נותר הליך מורכב למדי זמן רב. אוטומציה של שלבים רבים בשילוב עם תצוגת מידע יעילה יכולה מאוד לסייע experimentalists בביצוע מספר רב יותר של הקלטות עם אמינות גבוהה יותר ובפחות זמן. על מנת להשיג את הקלטות בקנה מידה גדולה שסכמנו את הגישה היעילה ביותר היא לא automatize באופן מלא בתהליך, אבל כדי לפשט את הצעדים הניסיוניים ולהפחית את הסיכוי לטעויות אנוש תוך שילוב ניסיונו של הנסיין ומשוב חזותי ביעילות. עם מטרות אלה בחשבון שפיתחנו מערכת ממוחשבת המרכזת את כל הבקרות הנדרשות לניסוי רב האלקטרודה תיקון מהדק בממשק יחיד, commercgamepad האלחוטי זמין ially, תוך הצגה ברמזי מידע והדרכה ניסוי קשורות במסך המחשב. כאן אנו מתארים את המרכיבים השונים של המערכת שאפשרה לנו להפחית את הזמן הנדרש להשגת את תצורת ההקלטה ולהגדיל באופן משמעותי את הסיכוי להקלטה בהצלחה מספר גדול של תאי עצב בו זמנית.
Introduction
היכולת להקליט ולעורר מספר אתרים עם דיוק מיקרומטר היא מאוד שימושית עבור ניסוי השגת הבנה טובה יותר של מערכות עצביות. טכניקות רבות פותחו למטרה זו אבל אף מאפשרות הרזולוציה submillivolt מושגת על ידי טכניקת תיקון מהדק, חיונית ללימוד פעילות התת ופוטנציאלי postsynaptic בודדים. כאן אנו מכסים את פיתוחה של מערכת התיקון-clamp שנתי עשר האלקטרודה בעזרת מחשב שמטרתה הקלטה בו זמנית ומגרה מספר רב של תאים בודדים בדייקנות מספיק ללימוד קישוריות עצבית. אמנם יכולים להיות יזום יישומים רבים אחרים למערכת כזו, זה משאיל את עצמו במיוחד גם ללימוד קישוריות הסינפטית בהתחשב בעובדה שמספר חיבורים אפשריים בתוך קבוצה של נוירונים גדל באופן פרופורציונלי לריבוע מספר הנוירונים בשאלה. לכן, בזמן שמערכת עם שלוש אלקטרודות מאפשרת בדיקהמופע של עד שישה חיבורים ולרוב הקלטה אחת, הקלטת עשרה נוירונים מאפשר בדיקת ההתרחשות של עד 132 קשרים ולעתים קרובות התבוננות למעלה מתריסר (איור 1). התצפית של עשרות חיבורים בו זמנית מאפשרת לנתח את הארגון של רשתות קטנות ולהסיק מאפיינים סטטיסטיים של מבנה הרשת שלא יכול להיות נחקר אחר 1. יתר על כן, גירוי מדויק של תאים רבים גם מאפשר כימות של גיוס של תאי postsynaptic 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
שאלה מיידית שעולה בדרך כלל בדבר שיעור הצלחה של ההליך שתארנו מ. לשיעורי הצלחה גבוהים הכנה היא חיונית. טפטפות חייבת להיות פתחי קצה שנחשבים כמספיקים לאדם התאים שנרשם. סינון הפתרון תאיים, כדי למנוע טפטפות הסתומה הוא גם חשוב. טפטפות מאוד נקייה, טרי משכה הן דרישה אחרת. התפלג…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לגלעד זילברברג, מישל Pignatelli, תומאס ק ברגר, לוקה Gambazzi, וסוניה גרסיה לייעוץ רב ערך על שיפורים לאוטומציה הליך תיקון מהדק. אנו מודים Rajnish ראנג'אן לקבלת ייעוץ וסיוע ביישום תוכנה יקרים. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי האיחוד האירופי בפרויקט סינפסה ובחלקו על ידי התכנית למדע הגבולות האנושי.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
Referências
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
