A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador
Summary
Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.
Abstract
A técnica de patch-clamp é hoje o método mais bem estabelecido para gravar a atividade elétrica dos neurônios individuais ou seus compartimentos subcelulares. No entanto, a realização gravações estáveis, mesmo a partir de células individuais, continua a ser um processo demorado de considerável complexidade. Automação de muitos passos em conjunto com display de informação eficiente pode ajudar muito experimentalistas na realização de um maior número de gravações com maior confiabilidade e em menos tempo. A fim de alcançar as gravações em grande escala que concluiu a abordagem mais eficaz não é de automatizar totalmente o processo, mas para simplificar os passos experimentais e reduzir as possibilidades de erro humano, enquanto que incorpora de forma eficiente a experiência do experimentador e o feedback visual. Com esses objetivos em mente, desenvolvemos um sistema assistido por computador que centraliza todos os controles necessários para uma experiência multi-eletrodo patch-clamp em uma única interface, um commercgamepad sem fio ei ra me nt disponível, durante a exibição de experimento relacionado informação e orientação pistas na tela do computador. Descrevemos aqui os diferentes componentes do sistema que permitiu reduzir o tempo necessário para atingir a configuração de gravação e substancialmente aumentar as chances de gravação com sucesso um grande número de neurónios em simultâneo.
Introduction
A capacidade de gravar e estimular vários sites com precisão micrômetro é extremamente útil para experimentalmente alcançar uma melhor compreensão dos sistemas neuronais. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para este fim, mas nenhuma permite a resolução submillivolt conseguida pela técnica de patch-clamp, essencial para o estudo da actividade de sublimiar e potenciais pós-sinápticos individuais. Aqui vamos cobrir o desenvolvimento de um sistema de patch-clamp assistida por computador doze eletrodo destinado a registar simultaneamente e estimular um grande número de células individuais com uma precisão suficiente para o estudo da conectividade neuronal. Embora muitas outras aplicações pode ser concebida para um tal sistema, que se presta especialmente bem para o estudo da conectividade sináptica dado que o número de ligações possíveis dentro de um grupo de neurónios aumenta proporcionalmente ao quadrado do número de neurónios em causa. Por conseguinte, enquanto um sistema com três eléctrodos permite testar oocorrência de até seis ligações e na maioria das vezes a gravação de um único, a gravação doze neurónios permite testar a ocorrência de até 132 ligações e frequentemente mais de uma dúzia de observação (Figura 1). A observação de dezenas de ligações simultaneamente torna possível analisar a organização de redes pequenas e inferir propriedades estatísticas da estrutura de rede que não pode ser de outra forma sondado 1. Além disso, a estimulação precisa de numerosas células também permite a quantificação do recrutamento de células pós-sinápticas 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma questão imediata geralmente surge sobre a taxa de sucesso do procedimento foi descrito. Para altas taxas de sucesso preparação é essencial. Pipettes deve ter aberturas de ponta que são adequadas para os seres células gravadas. Filtração da solução intracelular para evitar pipetas entupidos também é importante. São impecáveis, pipetas acabadas de tirar são outra exigência. A distribuição binomial é o modelo mais simples que pode ser usado para entender como essas questões afetam o rendimento final…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi e Sonia Garcia para conselhos valiosos sobre melhorias para a automação de processo patch-clamp. Agradecemos Rajnish Ranjan para aconselhamento e assistência com implementação de software valioso. Este trabalho foi financiado em parte pelo projeto Synapse UE e, em parte, pelo Programa Ciência Fronteiras Humanos.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
Referências
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