Ett Datorstödd Multi-elektrod Patch-clamp System
Summary
Multielektrod patch-clamp inspelningar utgör en komplicerad uppgift. Här visar vi hur, genom att automatisera många av de experimentella steg, är det möjligt att påskynda den process som leder till kvalitativa förbättringar i prestanda och antalet inspelningar.
Abstract
Den patch-clamp teknik är i dag den mest väletablerad metod för att spela in elektrisk aktivitet från enskilda nervceller eller deras subcellulära fack. Icke desto mindre uppnå stabila inspelningar, även från enskilda celler fortfarande en tidskrävande procedur för avsevärd komplexitet. Automatisering av många steg i kombination med en effektiv informationsdisplay kan vara till stor hjälp experimental att utföra ett större antal inspelningar med större tillförlitlighet och på kortare tid. För att uppnå storskaliga inspelningar avslutade vi den mest effektiva metoden är inte att helt automatisera processen utan att förenkla de experimentella stegen och minska risken för mänskliga fel samtidigt effektivt införliva försöks erfarenhet och visuell feedback. Med dessa mål i åtanke utvecklade vi ett datorbaserat system som centraliserar alla kontroller som behövs för ett multielektrod patch-clamp experiment i ett enda gränssnitt, en commercially tillgängliga trådlösa gamepad, när de visar experimentrelaterad information och vägledning ledtrådar på datorskärmen. Här beskriver vi de olika komponenterna i systemet som tillät oss att minska den tid som krävs för att uppnå konfigurationen inspelning och kraftigt öka chanserna att lyckas spela in ett stort antal nervceller samtidigt.
Introduction
Förmågan att spela in och stimulera flera webbplatser med mikrometerprecision är mycket användbart för experimentellt uppnå en bättre förståelse av neuronala system. Många tekniker har utvecklats för detta ändamål men ingen tillåter submillivolt upplösning uppnås av patch-clamp teknik, väsentliga för att studera subthreshold aktivitet och individuella postsynaptiska potentialer. Här täcker vi utvecklingen av en tolv-elektrod datorstödd patch-clamp system som syftar till att samtidigt spela in och stimulera ett stort antal enskilda celler med tillräcklig noggrannhet för att studera nervkopplingar. Medan många andra applikationer kan tänkas för ett sådant system, lämpar den sig särskilt väl till studiet av synaptisk konnektivitet med tanke på att antalet möjliga anslutningar inom en grupp av nervceller växer proportionellt mot kvadraten på antalet neuroner i fråga. Därför, medan ett system med tre elektroder tillåter testning avförekomst av upp till sex anslutningar och oftast spelar in en enda, inspelning tolv nervceller låter testa förekomsten av upp till 132 kontakter och ofta observera över ett dussin (Figur 1). Observationen av dussintals anslutningar gör samtidigt det möjligt att analysera organisationen av små nätverk och sluta statistiska egenskaper hos den nätverksstruktur som inte kan undersökas på annat 1. Dessutom exakt stimulering av många celler gör också kvantifiering av rekrytering av postsynaptiska celler 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
En omedelbar fråga uppstår oftast när det gäller graden av framgång i förfarandet som vi beskrev. För höga andelen framgångsrika förberedelser är viktigt. Pipetter måste ha spetsöppningar som är lämpliga för cellerna varelser registrerats. Filtrering av den intracellulära lösningen för att undvika igensatta pipetter är också viktigt. Extremt rena, nyligen drog pipetter är ett annat krav. En binomialfördelning är den enklaste modellen som kan användas för att förstå hur dessa frågor påverkar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, och Sonia Garcia för värdefulla råd om förbättringar för patch-clamp automation. Vi tackar Rajnish Ranjan för värdefulla råd och hjälp med programmeringen. Detta arbete har finansierats delvis av EU Synapse-projektet och dels av Human Frontiers Science Program.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
Referências
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
- Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
- Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
- Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
- Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
- Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
- Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).
