Bu makale sülükler kullanılarak üç sinir sistemi hazırlıkları anlatmaktadır: Hücre içi kayıt ventral gangliada nöronların, ventral ganglionlar nöronları kültüre ve duyusal alanları haritaya innerve deri bir yama kayıt.
Tatlı su sülük, Hirudo medicinalis, nörofizyoloji, neuroethology ve gelişimsel biyoloji alanlarında bilimsel soruları için kullanılan çok yönlü bir model organizmadır. Bu raporun amacı, diğer sinir sistemi hazırlıkları uzmanlığı ile fizyolog için kullanım olacak, ya da çok az veya hiç elektrofizyoloji deneyimi ile biyoloji öğrencilerine bir tek madde haline sülük sistemden deneysel teknikleri konsolide etmektir. Biz ganglion tanımlanan sinirsel devreler gelen hücre kayıt için sülük incelemek nasıl gösterilmektedir. Daha sonra fonksiyonu bilinen tek tek hücreler bir Petri kabındaki kültür edilmesi ganglion ve nasıl kültürde bu nöronlardan kaydetmek için kaldırılabilir şeklini göstermektedir. Sonra duyusal veya motor alanlarını haritalama için kullanılacak innerve deri bir yama nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu sülük hazırlıklar hala yaygın nöral networ temel elektriksel özelliklerini adreslemek için kullanılırks, davranış, sinaptogenez ve geliştirme. Onlar da nörobilim veya fizyoloji öğretim laboratuvarları için uygun bir eğitim modülü vardır.
Sülük hazırlanması tanımlanabilir (duyusal, motor ve hayvanın merkezi sinir sistemi (CNS) içinde arası nöronların fonksiyonu araştırmak için yararlıdır. Sülük nöronların yararlı özelliği eylem potansiyelleri ve biyofiziksel özellikleri şekli için karakteristik olmasıdır belirli bir hücre tipi (örneğin, P, N, T, Rz). Ayrıca nöron hücreler, 45 gün kadar uzun 1,2 olarak onların elektriksel özelliklerini muhafaza ettiği bir uygun ortam içinde kültürlenen hayvan ve kaldırılabilir.
Elektrofizyolojik kayıtları yapmak için öğrenmek için sülük ganglion belirgin bir avantajı hücreleri karakteristik ve güvenilir sağlayan bir desen ganglion düzenlenmiş olmasıdır ganglion ganglion ve hayvandan hayvana farklı hücre tiplerinin belirlenmesi. Eşsiz konumu ve sülük gangliada nöronların morfolojisi gibi erken 1891 3 olarak retzius tarafından kaydedildi. Th Bilgie kimlik bir nöronun fonksiyonu sinir devreleri araştırmak için ve belirli bir hücre tipi ile deneyler yapmak için avantajlıdır. Nedeniyle, bir mikroskopla görülebilir ve somata seçici elektriksel özelliklerini kayıt için mikro elektrod ile kazığa edilebilir bir ganglion içinde nöronların nispeten büyük somata için.
Boyalar ve büyük moleküllerin tek tek hücreler ve yama kelepçe tarafından incelenmiştir kanal özellikleri içine enjekte edilebilir. Çeşitli nöronlarda karakteristik aksiyon potansiyellerinin çeşitli şekillerde doğuran İyonik akımları 4-7 tespit edilmiştir. Inervasyonunun desen ve CNS içindeki bireysel nöronların dallanma araştırmalardan, sinaptik bağlantıları tespit nöronlar 2,8 ile kültür çoğaltılamaz edilmiştir. Sülük gangliyonlarında Çalışmalar whol yanı sıra elektrofizyoloji ile ölçülebilir fonksiyonel devrelerinin gelişimi içgörü sağladıE hayvan davranış çalışmaları. Sülük MSS ayrıca tüm hayvan ve kültür 4-6,9-12 nöronal tamir ve rejenerasyon ile ilgili mekanizmaların araştırılması için değerli bir hazırlık olarak hizmet vermiştir.
Memeli beyinlerinde bu özellikleri ve bireysel tespit nöronların bağlantıları açısından davranışlarını açıklamak için zor bir iştir. Prensip olarak böyle bir sülük gibi daha az karmaşık sistemlerin çalışma yüksek hayvanlarda kullanılan temel mekanizmaları tanımlamak için yardımcı olabilir umut olabilir. Yüzmek desen 13,14 ve kalp ritmini 15 altında yatan kullanılan bağlantıları de sülük karakterize edilmiştir. Hem elektriksel ve kimyasal iletişimi oluşturmak için bazı sülük nöronların yeteneği merak uyandırıcı. Diğer kimyasal olarak tek yönlü, çift yönlü, ancak elektriksel 7 ise bazı bağlantıları iki yönlüdür. Hayvan içinde sinaptik bağlantıları anlama yanı sıra aynı tipik değer yenidenbir kültür çanak bağlantıları e sinaptogenez 16-18 gibi sinaps 19 farmakolojik profil araştırmak için güçlü araçlardır. Burada anlatılan hücre içi kayıt ve stimülasyon teknikleri neuroethology ve geliştirme farmakolojik deneyler ve araştırmalar için bir temel sağlar.
Buna ek olarak, segmental ventral sinir kablosu innerve deri bir yama ile disseke edilebilir. Canlı bir deri yaması ve nöronları korumak için yeteneği ile, duyu açık alanları CNS'de ilgili karın ganglion içinde duyu nöronlarının hücre gövdesi (yani soma) elektrik sinyalleri kayıt ile problanabilir. Böylece tek bir ciltte yürürlüğe değişen derecelerde uygulayarak duyusal uçlarının duyarlılığını değerlendirmek ve açık alanları eşleyebilirler: hafif dokunma, basınç, ve zararlı (ağrılı) 20,21 uyaranlara.
Bu sülük ganglion-cilt hazırlama bir avantajı, bir can anatomik açık alan harita çizmek ve elektriksel tepkiler kaydedilmiş ediliyor kez tanımlanan nöron nöronal süreçleri iz. Aşağıda açıklanan üç sülük deneyler, her akademik laboratuvarlar için bu maliyetli bir öğretim modülü kılan tek bir numune ile birden çok kez tamamlanabilir.
Bu deney setinin amacı 1) öğretmek ve sergi hücre içi kayıtları temel ilkelerini tanımlanabilir nöronlardan gelen ve 2) yetişkin sülükler kullanılarak bu özel nöronal türlerinden kaynaklanan elektrik sinyallerine karakteristik şekilleri tanımak oldu. Orada nörofizyolojik araştırmalar için sülük kullanan araştırmaların zengin bir tarih ve araştırma sinir devresi ve gelişimi sırasında hem de sinaptik onarım ve rejenerasyon 10 sırasında gen regülasyonu sorularını ele devam etmektedir. Nöromodülasyon, özellikle biyojenik amin yollar aracılığıyla, aynı zamanda sülük başarılı bir araştırma yönünde olmuştur. Tuzlu su çözeltisi ile sinir sistemine dopamin ve diğer farmakolojik ajanlar ekleyerek, dopamin karar verme davranışı 24,25 tarama için 23 ve motor modelleri dahil sinir ağları modüle gösterilmiştir. Bu deneysel yaklaşım, bir ahmak olduğunule (ve ucuz) öğretim laboratuvara modülasyonu dahil yolu, ve tuzlu su çözeltisinin iyonik makyaj ayarlayarak Nernst ve Goldman-Hodgkin-Katz denklemleri öğretmek için etkili bir yoldur.
Ganglion hazırlıkları ile başarılı olmak için, önce ganglion hücre içi bir elektrot ile bir soma kurcalamak için çalışırken gergin olması önemlidir. Glial paket aşağı iterek aksi takdirde soma hareket edecektir. Kültür nöronlar kaldırmak için ganglion desheathing zaman kaldırılır gibi somas zarar değil bu yüzden ganglion kesen Buna ek olarak, ilgi bölge önlemek. Ayrıca, enzimlerin aşırı inkübasyon nöronlar kaldırılması için çok kırılgan olması ile sonuçlanabilir. Bu enzimlerin her parti kendi eylemlerinin biraz farklı olduğu için ideal bir inkübasyon süresi elde etmek için bazı deneme ve yanılma gerektirir.
Kültür ortamını optimize etmek için daha fazla araştırma bu tekniği geliştirmek olabilir. Variinsülin, şeker, ve büyüme faktörlerinin varlığı gibi faktörleri lı, kültürlerin uzun bakım için incelenebilir. Hücreleri, Rz hücrelerinde serotonin sentezi gibi vericileri, sentezleme kapasitelerini muhafaza olmadığını belirlemek için, nötr kırmızı boyama işlemleri serotonerjik etiketlemek için uygulanabilir. Yaralı ve yenileyici dokuya da mikrogliyal işgali bir yaralanma sonrası nükleer lekeleri gün ile tayin edilebilir.
Bu hazırlık rejenerasyon ve onarım hem de sinir devresi incelerken sunmak için çok faydası vardır, ancak, sinapslarda, çeşitli reseptör alt-tiplerinin farmakolojik ve molekül kimlik tam olarak karakterize edilmemiştir. Bir sentezlenmiş dizi etiket kitaplığı 26 mevcuttur, ve tıbbi sülük genomdur 27 monte edilmektedir, ancak örnek preparatları ile karşılaştırıldığında sülük ana sınırlama spesifik hücre tiplerinde seçici gen için genomunu değişime uğratmaya yarayan yeteneğidir. Embriyolar TOnun sınırlama gen ifadesini 28 düzenleyen DNA veya dsRNA'yı enjekte tarafından ele alınmıştır. Gen tabancası tekniği son zamanlarda sülük nöronlarda omurgasız konneksin (innexin) proteinleri ifade etmek için kullanılmıştır. Hirudo verbana (Hve-inx6) bir innexin sentezlenmesi tıbbi sülük 29 ektopik boşluk bağlantıları oluşumu için yeterlidir. Tıbbi sülük veya H. 30 olduğu gibi verbena önümüzdeki birkaç yıl içinde fizyoloji ve elektriksel sinapsların evrim anlayışımızı ilerletmek için emin olabilirsiniz.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |