Impression Moules Reverse thermosensible pour la création de motifs d'hydrogels à deux composants pour la culture cellulaire 3D

Summary

A bioprinter été utilisé pour créer hydrogels motifs fondés sur un moule sacrificiel. Le moule poloxamère a été remblayé avec un second hydrogel et ensuite élue, laissant des vides qui ont été remplis avec un troisième hydrogel. Cette méthode utilise une élution rapide et une bonne imprimabilité de poloxamère pour générer des architectures complexes à partir de biopolymères.

Abstract

Bioprinting est une technologie émergente qui a ses origines dans l'industrie du prototypage rapide. Les différents procédés d'impression peuvent être divisés en contact bioprinting ^1-4 (extrusion, plongeon stylo et lithographie douce), ^5-7 (transfert avant laser, à jet d'encre dépôt) sans contact bioprinting et techniques à laser comme deux photopolymérisation photon ^8. Il peut être utilisé pour de nombreuses applications telles que l'ingénierie tissulaire ^{9-13, 14-16} et microfabrication biocapteur comme un outil pour répondre à des questions biologiques fondamentaux tels que les influences de co-culture de différents types de cellules ^17. Contrairement aux méthodes de photolithographie ou soft-lithographique communes, bioprinting d'extrusion a l'avantage qu'il ne nécessite pas un masque ou d'un cachet distinct. Grâce à un logiciel de CAO, la conception de la structure peut être rapidement modifiée et ajustée en fonction des besoins de l'opérateur. Cela rend bioprinting plus souple que la lithographie basée surapproches.

Ici, nous démontrons l'impression d'un moule sacrificiel de créer une structure multi-matériaux en 3D en utilisant un réseau de piliers dans un hydrogel à titre d'exemple. Ces piliers peuvent représenter des structures creuses pour un réseau vasculaire ou les tubes à l'intérieur d'un conduit de guidage de nerf. Le matériau choisi pour le moule sacrificiel est le poloxamère 407, un polymère thermosensible avec d'excellentes propriétés d'impression qui est liquide à 4 ° C et un solide ci-dessus de sa température de gélification ~ 20 ° C pendant 24,5% p / v de solutions ^18. Cette propriété permet à la moule sacrificiel poloxamère basée à élue à la demande et présente des avantages sur la lente dissolution d'un matériau solide en particulier pour les géométries étroites. Poloxamer a été imprimé sur des lames de verre de microscope pour créer le moule sacrificiel. Agarose a été pipette dans le moule et refroidi jusqu'à la gélification. Après élution de la poloxamère dans de l'eau glacée, les vides dans le moule d'agarose ont été remplis avec de l'alginate méthacrylate spIKED avec FITC fibrinogène marqué. Les vides remplis sont ensuite réticulées aux UV et la construction a été imagé avec un microscope à épifluorescence.

Introduction

approches d'ingénierie tissulaire ont fait beaucoup de progrès au cours des dernières années en ce qui concerne la régénération des tissus et d'organes humains ^19,20. Cependant, jusqu'à présent, l'objet de l'ingénierie tissulaire a été souvent limitée aux tissus qui ont une structure simple ou petites dimensions comme la vessie ou de la peau ^{21,22 23-25.} Le corps humain contient cependant de nombreux tissus complexes en trois dimensions où les cellules et la matrice extracellulaire sont disposées d'une manière définie dans l'espace. Pour la fabrication de ces tissus, une technique est nécessaire qui peut placer les cellules et les échafaudages de la matrice extracellulaire à l'intérieur d'une construction en trois dimensions à des positions spécifiées. Bioprinting a le potentiel pour être une telle technique où la vision de la fabrication des tissus complexes en trois dimensions peut être réalisée ^10,11,26-28.

Bioprinting est définie comme «l'utilisation de procédés de transfert de matériel pour la modélisation et l'assemblage biologiquement relmatériaux nentes – molécules, cellules, tissus et biomatériaux biodégradables -. avec une organisation prescrite pour accomplir une ou plusieurs fonctions biologiques ^»4 Elle englobe plusieurs techniques différentes qui fonctionnent à différentes résolutions et échelles de longueur, allant de la résolution submicronique de deux polymérisation photons ²⁹ à une résolution de 150 um à 420 um pour l'impression d'extrusion ^1,12,30. Pas un seul matériau ou combinaison de matériaux saura satisfaire les exigences de chaque méthode ^31. Pour l'impression d'extrusion, les paramètres clés sont la viscosité et le temps de gélification ^32, où la haute viscosité et la gélification rapide est souhaitable.

L'impression 3D est une technique qui permet la création facile de moules sacrificiels pour créer des géométries complexes ^30,33,34. Ce procédé est basé sur la construction d'un moule en utilisant une technique de prototypage rapide tel qu'un bioprinter d'extrusion. Le moule sacrificiel créée est utiliséepour former des structures complexes à partir de matériaux qui sont difficiles à imprimer du fait de leur faible viscosité et temps de gélification lente. La méthode présentée ici consiste en la création d'un moule sacrificiel consistant en un matériau qui se dissout rapidement à basse température et qui peut être extrudé avec précision. Le copolymère à blocs poly (éthylène glycol) _99-poly (propylène glycol) _67-poly (éthylène glycol) ₉₉ (également connu sous le nom de Pluronic F127 ou le poloxamère 407) répond à ces exigences. Il a déjà été utilisé dans une version modifiée de l'impression d'extrusion ^1, mais, à notre connaissance, n'a jamais été utilisé pour l'impression dans sa version non modifiée en raison de son instabilité dans les milieux liquides. Poloxamer 407 montre également un comportement réactif thermique inverse ¹⁸ c'est à dire qu'il passe d'un gel à un sol lors du refroidissement. Plus important encore, il peut être imprimé dans des structures courbes arbitrairement complexes avec une très grande fidélité. Cela permet la création d'un hydrogel structuré à partir d'unun matériau à faible viscosité, en l'occurrence gélifiant lente d'agarose, à la pipette de la solution dans le moule sacrificiel imprimé. La combinaison de l'impression du moule sacrificielle avec une grande fidélité et son élution rapide de l'hydrogel structuré coulé en fait un procédé rapide et flexible pour créer des moules avec des géométries différentes, sans l'utilisation d'un masque ou d'un timbre comme il est souvent nécessaire dans les procédés lithographiques. L'hydrogel structuré coulé peut encore être rempli avec un autre matériau qui n'est pas adapté à l'impression d'extrusion en raison de sa faible viscosité. Il s'agit dans notre cas une solution de méthacrylate bas d'alginate de viscosité. Ici, nous présentons la méthode de thermosensibles moules sacrificiels inverse pour motif d'hydrogel en utilisant l'exemple d'un tableau de pilier.

Protocol

1. Préparation de la Solution 407 Poloxamer Le cas échéant, réaliser la préparation de la solution de poloxamère dans une chambre froide (4 ° C). S'il n'est pas disponible, placez une bouteille en verre dans un bécher rempli d'eau glacée. A des températures plus élevées, le poloxamère sera au-dessus du point de gel et ne se dissoudra pas correctement. Ajouter 60 ml de solution PBS froid dans une bouteille en verre et agiter vigoureusement à l'aide d&#…

Representative Results

Les résultats représentatifs montrent que la technique de moulage de marche arrière (représentée sur la figure 2) va créer un gel structurée pouvant être remplie d'un second matériau. Au début de chaque processus d'impression, les paramètres d'impression sont d'abord optimisés. Ajustements progressive des paramètres se traduira par des constructions multicouches imprimés illustrés à la figure 3 et la figure 4 lorsque les lignes simples so…

Discussion

Nous présentons ci, pour la première fois, l'utilisation d'un polymère thermosensible pour un moule sacrificiel qui peut être rapidement éluée à l'eau froide due à la transition gel-sol de poloxamère de ~ 20 ° C. La vitesse de l'ensemble du processus fait poloxamère intéressant pour la création rapide des structures de biopolymères qui ne peut être imprimé avec une résolution suffisante. La technique décrite ici peut être utilisé pour la modélisation d'un hydrogel dans une autre …

Materials

			REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)	Sigma	P2443
PBS	Invitrogen	10010-015
CAD software	regenHU	BioCAD
Alginate methacrylate	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose	Lonza	50004
			EQUIPMENT
Bioprinter	regenHU	Biofactory
Valve	regenHU	300 μm Nozzel Diameter
Needle	regenHU	150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome	Zeiss
UV Light Source	UVP	Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp	100 W