Propportionell Biosensors som mäter Mitokondriell redoxtillstånd och ATP i Living jästceller

Summary

Vi beskriver användningen av två ratiometrisk, genetiskt kodade biosensorer, som är baserade på GFP, för att övervaka mitokondrie redoxtillstånd och ATP-nivåer vid subcellulärt upplösning i levande jästceller.

Abstract

Mitokondrierna har roller i många cellulära processer, från energiomsättning och kalciumhomeostas att styrningen av cellernas livslängd och programmerad celldöd. Dessa processer påverkar och påverkas av den redox status och ATP produktionen av mitokondrier. Här beskriver vi användandet av två ratiometrisk, genetiskt kodade biosensorer som kan upptäcka mitokondriell redoxtillstånd och ATP-nivåer vid subcellulärt upplösning i levande jästceller. Mitokondriell redoxtillstånd mäts med redox-känsliga grönt fluorescerande protein (roGFP) som är riktad till den mitokondriella matrisen. Mito-roGFP innehåller cysteiner i positionerna 147 och 204 av GFP, som genomgår reversibel och miljö-beroende oxidation och reduktion, vilket i sin tur förändrar excitationsspektrumet av proteinet. MitGO-ATeam är en Förster resonance energy transfer (FRET) sond i vilken ε-subenheten av F _o F _1-ATP-syntas är inlagt mellan FRET donator och acceptor fluorescent proteiner. Bindning av ATP till resultaten ε subenheten i konformationsförändringar i proteinet som ger FRET donator och acceptor i omedelbar närhet och möjliggöra fluorescensresonansenergiöverföring från donatorn till acceptorn.

Introduction

Mitokondrierna är viktiga organeller för ATP-produktion, biosyntes av aminosyror, fettsyror, häm, järn svavel kluster och pyrimidiner. Mitokondrierna spelar också avgörande roller i kalciumhomeostas, och i regleringen av apoptos. ¹ öka kontakterna bevis mitokondrier till åldrande och åldersrelaterade sjukdomar som Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, amyotrofisk lateralskleros, och Huntingtons sjukdom. ² Medan individer lever hela sina liv med mutationer i mitokondriernas proteiner som är associerade med neurodegenerativa sjukdomar, sjukdomssymptom uppstår först senare i livet. Detta indikerar att förändringar sker i mitokondrier med åldern som tillåter sjukdomspatologin att dyka. Faktum är mitokondrie fitness korrelerad med total cell hälsa och livslängd i jäst och däggdjursceller. ^3,4 Här beskriver vi hur du använder genetiskt kodade, ratiometrisk fluorescerande biosensorer för att bedöma två viktiga funktioner i mitochondria i levande jästceller: redoxtillstånd och ATP-nivåer.

Mitokondriell funktion i aerob energi mobilisering är väl etablerad. Mitochondrial redoxtillstånd är en produkt av reducerande och oxiderande arter i organell, inklusive NAD ⁺ / NADH, FAD / _FADH2, NADP ⁺ / NADPH, glutation / glutation disulfid (GSH / GSSG) och reaktiva syrespecies (ROS). Uncoupling mitokondrier eller hypoxi påverkar mitokondriella andningskedjan aktivitet och förändrar förhållandet mellan NAD ⁺ till NADH i organell. ROS, som framställts av ineffektiva elektron överföring mellan komplex av elektron transportkedjan i det inre mitokondrie membranet, samt från deamineringen av aminer via monoaminoxidas i yttre mitokondriemembranet ^5, lipider skador, proteiner och nukleinsyror och har varit kopplade till åldrande och åldersrelaterade associerade neurodegenerativa sjukdomar ^6,7,8. ROS spelar också en roll i signaltransduktion i mitochondria, genom oxidation av GSH. Till exempel, NADH dehydrogenas inte bara bidrar till ROS produktion men också regleras genom interaktioner med glutation pool ^9,10. α-ketoglutarat dehydrogenas och Aconitase, komponenter i TCA-cykeln, uppvisar minskad aktivitet i oxiderande miljöer ^11,12.

Faktum är redox-beroende reglering av Aconitase aktivitet bevarad från bakterier till däggdjur ^13,14. Således, övervaka redoxtillståndet och ATP nivåer av mitokondrier är avgörande för att förstå deras funktion och roll i sjukdom patologi.

Biokemiska metoder har använts för att bedöma redoxtillståndet eller ATP-nivåer av hela celler eller isolerade mitokondrier. Använda metoderna för att bedöma redoxtillståndet av hela celler eller isolerade mitokondrier bygger på att mäta nivåerna av den redoxpar GSH / GSSG ^15. Luciferin-luciferas-systemet används ofta för att mäta mitokondrieATP-nivåer i antingen permeabiliserade hela celler eller isolerade mitokondrier. ^{16,17,18,19,20} i denna analys, binder luciferas till ATP och katalyserar oxidationen av och kemiluminescens från luciferin. ²¹ Intensiteten av det utsända ljuset är proportionell mot mängden av ATP i reaktionsblandningen. ²²

Dessa metoder har avslöjat grundläggande information om mitokondriell funktion, inklusive den slutsatsen att patienter med neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, har onormalt låga ATP-nivåer. ²³ Men de kan inte användas för att avbilda levande, intakta celler. Dessutom, metoder baserade på helcell-analys ger ett genomsnitt av redoxtillstånd eller ATP-nivåer i alla fack i cellen. Mätningar i isolerade organeller är potentiellt problematiskt eftersom mitokondrie redoxtillstånd eller ATP-nivåer kan ändras under subcellulär fraktionering. Slutligen, nya studier från vårt laboratorium och andra visar attmitokondrier inom enskilda celler är heterogena i funktion, vilket i sin tur påverkar livslängden på mor och dotter-celler. ³ Det finns således ett behov av att mäta mitokondrie ATP-halter och redoxtillstånd i levande celler med subcellulär upplösning.

De biosensorer för mitokondriell funktion beskrivs här är båda baserade på GFP. Redox-känslig GFP (roGFP) ^24,25 är en GFP variant där ytexponerade cysteiner tillsättes till molekylen. roGFP, liksom vildtyps-GFP, har två excitations topparna (vid ~ 400 nm och ~ 480 nm) och en emissionstopp vid ~ 510 nm. Oxidation av cysteinresterna i roGFP resulterar i en ökning av excitation vid ~ 400 nm. Minskning av dessa cysteiner gynnar excitation vid ~ 480 nm. Sålunda avslöjar förhållandet 510 nm emission vid excitering av roGFP vid 480 nm och 400 nm den relativa mängden av reducerad och oxiderad roGFP, som återspeglar redoxtillstånd av fluoroforen miljö.

Två versjoner av roGFP används ofta: roGFP1 och roGFP2. Båda innehåller samma cystein infogningar. roGFP1 baseras på naturligt GFP och roGFP2 baseras på S65T GFP, som har mer effektiv excitation vid 480 nm och mindre effektiv excitation vid 400 nm jämfört med wtGFP ^24. roGFP1 är mindre pH-känslig än roGFP2 och dess dynamiska omfång sträcker sig vidare in i den reducerade intervall. Således kan roGFP1 vara mer användbara för övervakning mer reducerande fack såsom mitokondrier eller cytosolen och delområden med varierande pH, såsom endosomer. roGFP2 erbjuder ljusare signal och, i vissa studier, ett större dynamiskt omfång än roGFP1 ^24,26. Studier i Arabidopsis thaliana tyder på att den tid som krävs för att svara på förändringar i redoxtillstånd är likartad för båda sensorerna (t ½ för oxidation, 65 och 95 sekunder och t ½ för reduktion, 272 och 206 sek, för roGFP1 och roGFP2, respektive). ²⁶

MitGO-ATeam2 är en minimalt invasiv, tillförlitligsensor som mäter mitokondriell ATP i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam är en Förster resonance energy transfer (FRET) sond som består av ε-subenheten av F _o F _1-ATP-syntas inklämt mellan FRET donator-och acceptor-fluorescerande proteiner (GFP och orange fluorescerande protein (OFP), respektive). ²⁷ Bindning av ATP till resultaten ε subenheten i konformationsförändringar i proteinet som ger FRET donator i nära anslutning till acceptorn och möjliggöra energiöverföring från donator till acceptor. Det finns två varianter av GO-ATeam, GO-ATeam1 och GO-ATeam2. GO-ATeam2 har en högre affinitet för MgATP än GO-ATeam1, vilket gör den mer lämplig för mätning av den typiskt lägre [ATP] i mitokondrier i förhållande till cytosolen. ²⁷

Att söka mitokondriella redoxtillstånd, konstruerade vi ett fusionsprotein (mito-roGFP1) bestående av roGFP1 fuserad till ATP9 ledarsekvensen ennd uttryckt från en centromer-baserad (lågt kopietal) jästexpressionsplasmid under kontroll av den starka glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GPD)-promotorn (p416GPD, Addgene). Vi använde roGFP1 att sondera redox status mitokondrier i samband med åldrandet av modellen svampen Saccharomyces cerevisiae. Vi finner att roGFP1 kan upptäcka förändringar i mitokondriell redoxtillstånd som inträffar under åldrande och som svar på tillgången på näringsämnen men har ingen uppenbar skadlig effekt på jästceller. Vi ser även variabilitet i redoxtillståndet av mitokondrier inom enskilda celler levande jäst, ett konstaterande som understryker vikten av en biosensor med subcellulär rumslig upplösning.

MitGO-ATeam2 är en variant av GO-ATeam2, som har den mitokondriella signalsekvensen av cytokrom c oxidas subenhet VIIIA insatt vid aminoterminalen av GO-ATeam2. ²⁷ Vi modifierade den mitGO-ATeam2 sond (tillhandahölls vänligt av laboratoriet av H. Noji, institf vetenskaplig och industriell forskning, Osaka University, Japan) för användning i jäst genom subkloning det, via Xba1 och Hindlll, i jästexpressionsvektor pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), vilket är en låg-kopia plasmid innehåller den starka konstitutiva GPD promotor. Vi uttryckte mitGO-ATeam2 i spirande jäst, och finna, genom motfärgning med DNA-bindande färgämne DAPI, att den lokaliserar uteslutande till cellernas mitokondrier där det fungerar som ett effektivt sond för att mäta fysiologiska förändringar i mitokondriella ATP-nivåer.

roGFP och GO-ATeam är både genetiskt kodade. Som ett resultat, kan de införas och bibehållas stabilt i intakta celler, och ger information om redoxtillstånd eller ATP-nivåer i enskilda, levande celler. Dessutom är båda biosensorer övervaka förändringar i redoxtillstånd eller ATP-nivåer som förekommer under fysiologiska förhållanden. ²⁸ Båda sonderna är också ratiometrisk. Som ett resultat, är mätningar gjorda med dessa sönder påverkas inte av changes i Biosensor koncentration eller provbelysning eller tjocklek. Slutligen, båda biosensorer ger subcellular rumslig upplösning. Sannerligen, har roGFP varit riktade till mitokondrier, ER, endosomer och peroxisomerna ^24, och kan upptäcka förändringar i redox tillståndet för var och en av dessa organeller, till stor del oberoende av pH.

Protocol

Ett. Transformation av jästceller med Biosensors Förvandla önskad jäststam med plasmiden bärande Mito-roGFP eller mitGO-ATeam2 med metoden litiumacetat 27. För att bekräfta transformation med plasmidburna biosensor och för att förhindra förlust av plasmiden, välja och upprätthålla transformanter på lämpligt selektivt syntetiskt komplett medium (SC-Ura för mito-roGFP, eller SC-Leu för mitGo-ATeam2). Om den fluorescerande sonden har subklonats i en annan plasmid än de som …

Representative Results

Mätning mitokondrie redoxtillstånd med mito-roGFP Här visar vi att mito-roGFP1 har det dynamiska området för att upptäcka förändringar i mitokondriernas redoxtillstånd från helt oxideras till minskade i levande jästceller, utan att påverka tillväxten jäst cell eller mitokondriell morfologi. Först hittar vi celler som uttrycker mitokondrier riktade GFP och roGFP1 växa i normal takt (Figur 1A). Den högsta tillväxttakten, mätt som maximal lutning på tillväxtku…

Discussion

Här beskriver vi metoder att använda Mito-roGFP1 och mitGO-ATeam2 som biosensorer för att bedöma mitokondrie redoxtillstånd och ATP-nivåer i levande jästceller. Vi finner att uttrycket av plasmidburna Mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam resulterar i kvantitativ inriktning till mitokondrierna, utan någon uppenbar effekt på mitokondriell morfologi eller distributionen eller på cellulär tillväxt. ³ Mito-roGFP1 kan upptäcka förändringar i mitokondriernas redoxtillstånd från starkt oxideras till mycket …

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/