Ratiometrisk Biosensors, der måler Mitochondrial Redox stat og ATP i Living Gærcellers

Summary

Vi beskriver anvendelsen af ​​to ratiometrisk, genetisk indkodede biosensorer, som er baseret på GFP, til at overvåge mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer subcellulære opløsning i levende gærceller.

Abstract

Mitokondrier har roller i mange cellulære processer, fra energi metabolisme og calcium homeostase at styre af cellulær levetid og programmeret celledød. Disse processer påvirker og påvirkes af redox status og ATP produktion af mitokondrier. Her beskriver vi brugen af ​​to ratiometrisk, genetisk indkodede biosensorer, der kan opdage mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer subcellulære opløsning i levende gærceller. Mitokondrie redoxtrin måles ved hjælp af redox-følsomme grønt fluorescerende protein (roGFP), der er målrettet til det mitokondrielle matrix. Mito-roGFP indeholder cysteiner i positionerne 147 og 204 af GFP, der undergår reversibel og miljø-afhængig oxidation og reduktion, hvilket igen ændrer ekscitationsspektret af proteinet. MitGO-ATeam er en Förster resonans energi overførsel (FRET) sonde, hvor ε underenheden af F _o F _1-ATP syntase mellemlæg FRET donor og acceptor fluorescent proteiner. Binding af ATP til ε subunit resulterer i kropsbygning ændringer i proteinet, der bringer FRET donor og acceptor i tæt nærhed og muliggøre fluorescensresonansenergioverførsel fra donor til acceptor.

Introduction

Mitokondrier er væsentlige organeller til ATP-produktion, biosyntese af aminosyrer, fedtsyrer, heme, jern svovl klynger og pyrimidiner. Mitokondrier også spille afgørende roller i calciumhomeostase, og regulering af apoptose. ¹ stigende tegn links mitokondrier til aldring og aldersrelaterede sygdomme, herunder Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, amyotrofisk lateral sklerose og Huntingtons sygdom. ^2. Mens personer lever hele deres liv med mutationer i mitokondrielle proteiner, der er forbundet med neurodegenerative sygdomme, sygdomssymptomerne kun forekommer senere i livet. Dette indikerer, at der sker ændringer i mitokondrier med alderen, der tillader sygdom patologi at dukke op. Faktisk er mitokondrie fitness korreleret med generelle celle sundhed og levetid i gær-og pattedyrceller. ^3,4 Her beskriver vi, hvordan du bruger genetisk kodede Ratiometrisk fluorescerende biosensorer til at vurdere to kritiske funktioner i mitochondria i levende gærceller: redoxtrin og ATP niveauer.

Mitokondriefunktionen i aerob energi mobilisering er veletableret. Mitokondrie redoxtrin er et produkt af reducerende og oxiderende arter i organel, herunder NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, glutathion / glutathiondisulfid (GSH / GSSG) og reaktive oxygenarter (ROS). Afkobling mitokondrier eller hypoxi påvirker mitokondrie respiratoriske aktivitet og ændrer forholdet mellem NAD ⁺ til NADH i organel. ROS, som er fremstillet af ineffektive elektronoverførsel mellem komplekser af elektron transportkæden i den indre mitokondrielle membran, samt fra deaminering af aminer via monoaminoxidase i den ydre mitokondriemembran ^5, skader lipider, proteiner og nukleinsyrer og har været knyttet til aldring og alder-associerede neurodegenerative sygdomme ^6,7,8. ROS også spille en rolle i signaltransduktion i mitochondria gennem oxidation af GSH. For eksempel, ikke kun NADH dehydrogenase bidrager til ROS produktion, men også er reguleret gennem interaktioner med glutathion pool ^9,10. α-ketoglutarat dehydrogenase og aconitase, komponenter af TCA cyklus udviser nedsat aktivitet i oxiderende miljøer ^11,12.

Faktisk er redox-afhængig regulering af aconitase aktivitet bevaret fra bakterier til pattedyr ^13,14. Således overvågning redoxtilstanden og ATP niveauer af mitokondrier er afgørende for at forstå deres funktion og rolle i sygdom patologi.

Biokemiske metoder er blevet anvendt til at vurdere redoxtrin eller ATP niveauer af hele celler eller isolerede mitokondrier. Udbredte metoder til at vurdere redox tilstand af hele celler eller isolerede mitokondrier, er baseret på måle niveauet af redox parret GSH / GSSG ^15.. Luciferin-luciferase-systemet er almindeligt anvendt til at måle mitokondrieATP i enten permeabiliserede hele celler eller isolerede mitokondrier. ^{16,17,18,19,20} i dette assay, luciferase binder til ATP og katalyserer oxidationen af og kemiluminiscens fra luciferin. ^21. Intensiteten af det udsendte lys er proportional med mængden af ATP i reaktionsblandingen. ^22.

Disse metoder har afsløret grundlæggende oplysninger om mitokondrie funktion, herunder den konstatering, at patienter med neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, har unormalt lave ATP-niveauer. ^23. De kan dog ikke bruges til at afbilde levende, intakte celler. Desuden metoder baseret på helcelle-analyse giver et gennemsnit af redoxtrin eller ATP i alle rum i cellen. Målinger i isolerede organeller er potentielt problematiske, fordi mitokondrie redoxtrin eller ATP niveauer kan ændre sig i løbet subcellulær fraktionering. Endelig seneste undersøgelser fra vores laboratorium, og andre viser, atmitokondrier i de enkelte celler er heterogene i funktion, hvilket igen påvirker levetiden for mor og datter celler. ^3. Der er således et behov for at måle mitochondrielle ATP niveauer og redoxtilstanden i levende celler med subcellulær opløsning.

De biosensorer til mitokondriefunktionen beskrevet her, er begge baseret på GFP. Redox-følsomme GFP (roGFP) ^24,25 er en GFP variant, hvor overfladeeksponerede cysteiner tilsættes til molekylet. roGFP, ligesom vildtype-GFP, har to excitation toppe (ved ~ 400 nm og ~ 480 nm) og en emission topper ved ~ 510 nm. Oxidation af cysteinresterne i roGFP resulterer i en stigning i excitation ved ~ 400 nm. Reduktion af disse cysteiner favoriserer excitation ved ~ 480 nm. Således er forholdet mellem 510 nm emission ved excitation af roGFP ved 480 nm og 400 nm afslører den relative mængde af reduceret og oxideret roGFP, hvilket afspejler redoxtilstanden af ​​fluoroforen miljø.

To versioner af roGFP er meget udbredt: roGFP1 og roGFP2. Begge indeholder de samme cystein indrykninger. roGFP1 er baseret på vildtype-GFP og roGFP2 er baseret på S65T-GFP, som har en mere effektiv excitation ved 480 nm og mindre effektiv excitation ved 400 nm i forhold til wtGFP ^24.. roGFP1 er mindre pH følsom end roGFP2 og dens dynamikområde rækker længere ud i reducerede rækkevidde. Således kan roGFP1 være mere nyttigt for at overvåge mere reducerende rum såsom mitokondrier eller cytosolen, og segmenter med en variabel pH, såsom endosomer. roGFP2 tilbyder lysere signal og, i nogle undersøgelser, en større dynamikområde end roGFP1 ^24,26. Studier i Arabidopsis thaliana indikerer, at den tid, der kræves for reaktion på ændringer i redoxtilstand er ens for begge sensorer (t ½ til oxidation, 65 og 95 sek og t ½ for reduktion, 272 og 206 sek, for roGFP1 og roGFP2, henholdsvis). ^26.

MitGO-ATeam2 er en minimalt invasiv, pålideligsensor, der måler mitokondrie ATP i den spirende gæren Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam er en Förster resonans energi overførsel (FRET) sonde, der består af ε-underenheden af F _o F _1-ATP syntase klemt mellem FRET donor og acceptor fluorescerende proteiner (GFP og orange fluorescerende protein (OFP), henholdsvis). ^27. binding af ATP til ε subunit resulterer i konformationelle ændringer i proteinet, der bringer FRET donor i tæt nærhed til acceptoren og tillade energioverførsel fra donor til acceptor. Der er to varianter af GO-ATeam, GO-ATeam1 og GO-ATeam2. GO-ATeam2 har en højere affinitet for MgATP end GO-ATeam1, hvilket gør det mere egnet til at måle den typisk lavere [ATP] i mitokondrierne i forhold til cytosolen. ^27.

Til at sondere mitokondrie redoxtrin konstruerede vi et fusionsprotein (Mito-roGFP1) bestående af roGFP1 fusioneret til ATP9 ledersekvensen ennd udtrykt fra en centromer-baseret (lavt kopiantal) gærekspressionsplasmid under styring af den stærke glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Vi brugte roGFP1 til at undersøge redox status mitokondrier i forbindelse med aldring af modellen svampen Saccharomyces cerevisiae. Vi finder, at roGFP1 kan påvise ændringer i mitokondrie redoxtrin der opstår under ældning og som reaktion på tilgængeligheden af ​​næringsstoffer, men har ingen tilsyneladende skadelig virkning på gærceller. Vi ser også variabilitet i redox tilstand af mitokondrier i individuelle levende gærceller, en konstatering, der understreger vigtigheden af ​​en biosensor med subcellulær rumlig opløsning.

MitGO-ATeam2 er en variant af GO-ATeam2, som har mitokondrie signalsekvensen af cytochrom c-oxidase-underenhed VIII indsat ved aminoterminalen af GO-ATeam2. ^27. Vi modificerede mitGO-ATeam2 sonde (venligst tilvejebragt af laboratoriet H. Noji, Institut of videnskabelig og industriel forskning, Osaka University, Japan) til brug i gær ved subkloning det via Xba1 og HindIII-steder, ind i gærekspressionsvektoren pAG415GPD-CCDB (Addgene, Cambridge, MA, USA), hvilket er en lav-kopi plasmid indeholdende den stærke konstitutive GPD-promotor. Vi udtrykte mitGO-ATeam2 i spirende gær, og finde, ved modfarvning DNA-bindende farvestof DAPI, at det lokaliserer udelukkende for mitokondrier, hvor det fungerer som en effektiv probe til måling af fysiologiske ændringer i mitokondrie ATP niveauer.

roGFP og GO-ATeam begge genetisk kodet. Som et resultat, kan de blive introduceret og stabilt opretholdt i intakte celler, og giver oplysninger om redox stat eller ATP i individuelle, levende celler. Desuden har begge biosensorer overvåge ændringer i redox stat eller ATP niveauer, der opstår under fysiologiske betingelser. ^28. Begge sonder er også ratiometriske. Som et resultat, er målinger foretaget med disse prober ikke påvirket af changes i biosensor koncentration eller prøve belysning eller tykkelse. Endelig er begge biosensorer giver subcellulært rumlig opløsning. Faktisk har roGFP været målrettet til mitokondrier, ER, endosomer og peroxisomer ^24, og kan påvise ændringer i redoxtilstand af hver af disse organeller, stort set uafhængig af pH.

Protocol

1.. Transformation af gær celler med biosensorer Omdan den ønskede gærstamme med plasmid bærende Mito-roGFP eller mitGO-ATeam2 bruge lithiumacetatfremgangsmåden 27. For at bekræfte transformation med den plasmidbåret biosensor og for at forhindre tab af plasmidet, vælge og vedligeholde transformanter på passende selektivt syntetisk komplet medium (SC-Ura Mito-roGFP eller SC-Leu til mitGo-ATeam2). Hvis den fluorescerende probe er blevet subklonet i en anden plasmid end de her besk…

Representative Results

Måling mitokondrie redox tilstand med Mito-roGFP Her viser vi, at Mito-roGFP1 har det dynamiske område at konstatere ændringer i mitokondrie redoxtilstanden fra fuldstændigt oxideret til reduceret i levende gærceller, uden at det påvirker gærcellevækst eller mitokondrie morfologi. Først finder vi celler, der udtrykker mitokondrier målrettet GFP og roGFP1 vokse med normale satser (figur 1A). Den maksimale vækstrate, som målt ved maksimal hældning på vækstkurven un…

Discussion

Her beskriver vi metoder til at bruge Mito-roGFP1 og mitGO-ATeam2 som biosensorer til at vurdere mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer i levende gærceller. Vi finder, at ekspressionen af plasmidbårne Mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam resulterer i kvantitative mål for mitokondrier, uden nogen indlysende effekt på mitokondrie morfologi eller distributionen eller på cellulære vækstrater. ³ Mito-roGFP1 kan registrere ændringer i mitokondrie redoxtilstanden fra højt oxideret til stærkt reducerede tilstande. …

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/